1、背景和目的：惡性腫瘤是一類漸進(jìn)性細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制破壞的疾病，表現(xiàn)為細(xì)胞周期失調(diào)、信號傳導(dǎo)途徑異常。生物進(jìn)化過程中，細(xì)胞建立了一系列的調(diào)控機(jī)制，以確保細(xì)胞周期各時(shí)相嚴(yán)格有序地進(jìn)行。不受控制的細(xì)胞增殖是惡性腫瘤的最重要特征；多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均與細(xì)胞周期調(diào)控功能紊亂有關(guān)。因此，對細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制和腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控改變的深入研究，不僅有助于認(rèn)識腫瘤發(fā)生和演進(jìn)，還將為腫瘤治療開辟嶄新的思路。
　　 LKB1（Livet Kinas

2、e B1）基因是腫瘤易患綜合征-PJ綜合征（Peutz-Jeghers syndrome，PJS）的致病基因，在高達(dá)90％的PJS病人中可檢測到LKB1基因的胚系突變。LKB1基因的功能異常還與全身多種散發(fā)性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如在30-40％的非小細(xì)胞肺癌、20％宮頸癌、19％鱗狀細(xì)胞癌以及13％乳腺侵潤性導(dǎo)管癌中均有LKB1基因的失活。LKB1基因在惡性腫瘤發(fā)生中起著重要作用，研究證實(shí)LKB1能夠使細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制細(xì)胞生長

3、，但其機(jī)理尚不清楚。
　　 本課題通過構(gòu)建靶向LKB1基因的siRNA質(zhì)粒、LKB1基因野生型表達(dá)質(zhì)粒和LKB1基因無激酶活性的突變型表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人正常細(xì)胞株和癌細(xì)胞株，觀察LKB1的蛋白表達(dá)和激酶活性對細(xì)胞周期的影響，分析其中重要分子的表達(dá)和活性變化，以建立抑癌基因LKB1調(diào)控細(xì)胞周期的信號通路模型，揭示LKB1抑制細(xì)胞惡性增殖的分子背景。
　　 方法：（1）構(gòu)建靶向LKBl基因的3個(gè)siRNA表達(dá)質(zhì)粒，脂

4、質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293T和HUVEC細(xì)胞，免疫組化、western blot驗(yàn)證siRNA質(zhì)粒對LKB1表達(dá)的沉默效果，流式細(xì)胞術(shù)研究HEK293T和HUVEC細(xì)胞LKB1表達(dá)沉默后細(xì)胞周期的變化，western blot檢測細(xì)胞周期主要的調(diào)控組分Rb、磷酸化Rb、cyclin D1、cyclin E、p53、p21和p16的蛋白水平。
　　 （2）將LKB1基因野生型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不表達(dá)LKB1的Hela細(xì)胞，通過G418抗性

5、篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LKB1基因的Hela細(xì)胞系，流式細(xì)胞術(shù)研究LKB1蛋白穩(wěn)定表達(dá)對Hela細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，western blot檢測磷酸化Rb、PCNA、AMPKot及磷酸化AMPKα的蛋白水平，分析AMPK抑制劑Compound C對PCNA表達(dá)的影響。
　　 （3）通過體外定點(diǎn)突變技術(shù)，將LKB1蛋白激酶催化域第78位賴氨酸的編碼堿基突變?yōu)榧琢虬彼岬木幋a堿基，構(gòu)建無激酶活性的突變型LKB1基因表達(dá)質(zhì)粒，將LKB1基因野

6、生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)研究細(xì)胞周期的變化，western blot檢測磷酸化Rb、PCNA、AMPKα及磷酸化AMPKα的蛋白水平。
　　 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建靶向LKB1基因的3個(gè)siRNA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293T和HUVEC細(xì)胞后，3個(gè)干擾質(zhì)粒均能有效沉默LKB1蛋白表達(dá)，其中干擾質(zhì)粒pshRNA-1和pshRNA-3效果尤為明顯（抑制率>70％）。HEK293T和HUVEC細(xì)胞內(nèi)源性L

7、KB1表達(dá)沉默后，細(xì)胞G1期比例明顯下降，S期比例增加，Rb蛋白的磷酸化水平顯著增強(qiáng)，p53和p16表達(dá)顯著減弱，而總Rb蛋白、wclin D1、cyclin E表達(dá)水平無明顯變化。
　　 （2）成功構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LKB1基因的Hela細(xì)胞系LXB1蛋白穩(wěn)定表達(dá)的Hela細(xì)胞G1期比例明顯增加，S期比例減少，Rb蛋白的磷酸化水平、PCNA表達(dá)水平明顯降低，AMPKα的磷酸化水平明顯增強(qiáng)，當(dāng)用Compound C抑制Hela穩(wěn)定株細(xì)

8、胞AMPK活性后，PCNA蛋白表達(dá)水平明顯提高。
　　 （3）成功構(gòu)建無激酶活性的突變型LXB1基因表達(dá)質(zhì)粒，與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染LKB1野生型質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞G1期比例明顯增加，S期比例減少，Rb蛋白的磷酸化水平、PCNA表達(dá)水平明顯降低，AMPKa的磷酸化水平明顯增強(qiáng)，而LKB1突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后無明顯變化。
　　 結(jié)論：（1）在HEK293T和HUVEC細(xì)胞中沉默內(nèi)源性LKB1表達(dá)通過下調(diào)p53和