1、鼠疫[9]是一種自然疫源性的烈性傳染病,其病原體為鼠疫耶爾森菌[8],歷史上6世紀、14-15世紀、19世紀發(fā)生的3次世界性鼠疫大流行致使超過2億人喪生,給人類造成了巨大的災難[27]。近年來隨著國際反恐斗爭的需要[1],對鼠疫的防治研究已成為國際生物醫(yī)學界的研究熱點之一。
　　低鈣反應V抗原(Low-CalciumResponseVantigen,LcrV)是鼠疫耶爾森氏菌重要的毒力因子,同時也是鼠疫耶爾森氏菌主要的保護性抗原,

2、它構成了Ⅲ型分泌系統(tǒng)注射體的針尖,調(diào)控Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌,直接產(chǎn)生抗炎癥作用,因而在鼠疫菌的感染與免疫中發(fā)揮重要作用[7,51]。V抗原由326個氨基酸組成的,分子量37kDa,其273位氨基酸為半胱氨酸,可以此產(chǎn)生分子間二硫鍵形成同源二聚體[12,52],然而此半胱氨酸殘基在感染與免疫中的意義尚未見文獻報道。
　　接種鼠疫疫苗已被證明是預防鼠疫的有效手段[47]。目前世界上人用鼠疫疫苗主要有兩類,一類是全細胞滅活疫苗,其中甲醛滅

3、活的全菌苗(KWCV)曾在美國獲得FDA批準,然而已于1999年停止生產(chǎn)使用;另一類是減毒活疫苗,主要在我國和俄羅斯使用[15,16]。這兩種疫苗雖然安全有效,并曾被長期使用,但都存在一些缺陷,如生產(chǎn)安全性要求高,免疫操作或免疫程序復雜,質(zhì)控困難等。近年來,國內(nèi)外都在加緊發(fā)展新型鼠疫疫苗,研究發(fā)現(xiàn)重組F1[10]和LcrV抗原都能有效地保護實驗動物抵抗鼠疫菌攻擊,而二者聯(lián)用可產(chǎn)生比單獨使用更好的效果[20,23,28]。由于F1抗原缺失

4、的鼠疫菌仍然具有毒力,所以LcrV抗原的免疫效果對新型亞單位鼠疫疫苗至關重要[39]。美國和英國的鼠疫亞單位疫苗都已進入臨床試驗階段[43]。
　　新藥研發(fā)中的需要對產(chǎn)品質(zhì)量進行嚴格控制。V抗原因Cys273的存在導致其出現(xiàn)二聚體形式,雖然根據(jù)研究,單聚體和二聚體都具有免疫保護性,二聚體的免疫原性甚至更強,但實際生產(chǎn)過程中增加了質(zhì)量控制的難度。本研究制備了LcrVm蛋白,對LcrVm與LcrV在理化性質(zhì)、免疫原性等方面進行比較,研

5、究其作為新型亞單位鼠疫疫苗候選抗原的可行性。
　　大腸桿菌原核表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、技術操作簡便、生產(chǎn)周期短、培養(yǎng)條件簡單等特點,是最常用的外源蛋白表達系統(tǒng)之一。本研究在我們課題組先前已進行的―V抗原在大腸桿菌系統(tǒng)中的高效表達‖研究基礎上,考慮到V來自于原核細胞,分子量比較適中,選擇利用大腸桿菌系統(tǒng)表達突變體[2]。首先采用融合PCR的方法,將273位的半胱氨酸密碼子進行缺失突變,構建了突變體的基因,將PCR產(chǎn)物克隆到pMD-

6、18T載體上進行核苷酸序列分析,通過VectorNTI與原始序列進行比對,確定獲得了預期的突變體基因;再將突變體基因進行雙酶切后回收,亞克隆到表達載體pET-32a(+)的相應酶切位點,構建突變體的相應表達質(zhì)粒;表達質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,符合預期后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)過氨芐青霉素篩選,即獲得表達突變體的菌株;隨機挑取突變體的菌株接種到LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),待菌密度OD600達到大約1.5時,加入終濃度為0.4mM

7、的IPTG進行誘導,37℃誘導5小時,取誘導后菌液進行SDS-PAGE分析;結(jié)果顯示,突變體蛋白獲得高效可溶表達,大小約37kDa,符合預期,目的蛋白約占蛋白總量的46％[33]。
　　純化過程中,首先采用phenylsephroseFF疏水柱,捕獲目的蛋白,接著采用脫鹽柱去除鹽離子,再使用DEAE陰離子柱、phenylsephroseHP疏水柱、凝膠柱進行精細純化,去除雜蛋白和內(nèi)素素,獲得純度大于95%的突變體Vm抗原[2]。蛋

8、白N端氨基酸序列測定顯示結(jié)果與預期完全一致。獲得純化的蛋白后,采用Westernblotting等方法對其進行鑒定,表明V抗原突變體可與抗V單克隆抗體結(jié)合。進一步比較鑒定LcrV抗原突變體與LcrV抗原在理化性質(zhì)等方面的異同。
　　在此基礎上,將蛋白使用氫氧化鋁佐劑進行吸附[26],在小鼠體內(nèi)進行了免疫原性研究,通過ELISA檢測免疫血清效價,并比較聯(lián)合免疫組和單獨免疫組之間體液免疫反應的差異。結(jié)果表明,Vm抗原和V抗原的免疫原性