1、背景：
　　腹瀉是嚴重危害人類健康的重要疾病之一，全球每年約有40億人次發(fā)病，并造成300～400萬患者死亡?？v然很多治療措施和藥物已被采用，但在全球范圍內(nèi)，腹瀉總體的發(fā)病率和死亡率未見明顯改善，即便在發(fā)達國家，兒童腹瀉也有較高的發(fā)病率和死亡率，因而尋求新的治療腹瀉藥物成為當代研究的熱點。生理狀態(tài)下，腸道上皮細胞存在大量離子通道及轉(zhuǎn)運體，維持腸道的吸收和分泌處于平衡狀態(tài)。但當致瀉因素或物質(zhì)，如細菌、病毒感染和毒素等作用于腸道時，這

2、些離子通道及轉(zhuǎn)運體的表達和（或）活性就會發(fā)生改變，從而打破吸收和分泌間的平衡，造成大量的水電解質(zhì)丟失，嚴重者可導(dǎo)致患者死亡，因而腹瀉的本質(zhì)在于腸道分泌功能與吸收功能之間的平衡失調(diào)。在過去的幾十年中，科研工作者一直致力于尋找影響腸道吸收或分泌的藥物，小檗堿作為其中候選的一員，對霍亂毒素或致腸病性大腸桿菌引起的分泌性腹瀉具有良好的療效，提示小檗堿可能通過影響腸道的分泌或吸收來發(fā)揮治療腹瀉的作用。
　　小檗堿(berberine)是從黃

3、連、黃柏等多種植物中提取(或人工合成)的生物堿，具有廣泛的生物學作用，主要包括：抑制病原微生物的代謝，抑制腸液積聚及電解質(zhì)分泌，抑制炎癥反應(yīng)，刺激膽汁及膽紅素分泌以及抑制快速性室性心律不齊等等，但最為主要的還是用于腹瀉的治療。在中國，小檗堿作為傳統(tǒng)中藥黃連素的主要成分，用于治療腹瀉已有數(shù)千年的歷史，但其作用機制目前還未完全闡明。既往研究認為小檗堿主要通過抑菌作用來實現(xiàn)腹瀉的治療，但是僅僅抑菌作用并不能解釋全部，特別是分泌性腹瀉。在動物模

4、型，小檗堿可以逆轉(zhuǎn)霍亂毒素引起的腹瀉，提示小檗堿能夠影響腸道的分泌與吸收。更為重要的是，小檗堿是目前中藥中為數(shù)不多的可以人工合成的小分子化合物。通過對其生物學活性及作用機制的進一步探討，不僅有助于了解其分子機制和作用靶點，而且可以通過建立的分子作用模型，為獲得更為高效的腹瀉治療藥物奠定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1.建立腹瀉模型，觀察小檗堿的治療效果2.研究小檗堿是否通過影響離子通道及轉(zhuǎn)運體的表達來達到治療腹瀉的效果3.初步探討

5、小檗堿影響離子通道及轉(zhuǎn)運體表達的可能分子機制
　　方法：
　　1.將BALB/c小鼠隨機分為空白對照組、腹瀉組和小檗堿處理組，分別給予生理鹽水、20mg/kg番瀉苷A、以及20mg/kg番瀉苷A和80mg/kg小檗堿灌胃。計數(shù)灌胃后12h內(nèi)小鼠出現(xiàn)的腹瀉次數(shù)及小鼠的體重變化，觀察小檗堿的治療效果。2.刮取小鼠近端結(jié)腸上皮細胞，采用半定量RT-PCR檢測影響腸道吸收和分泌的主要離子通道：鈉-氫交換體家族(NHE1-NHE3)、

6、水通道蛋白家族(AQP4和AQP8)、AE1、CFTR、和SGLT1的表達變化。3.利用免疫組織化學的方法驗證RT-PCR的結(jié)果。4.應(yīng)用RT-PCR和westernblotting方法在人腸上皮細胞（HIEC）中作進一步證實。結(jié)果：
　　1.20mg/kg番瀉苷A灌胃1～1.5h后，所有小鼠均出現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀，腹瀉癥狀約持續(xù)5～6h。在連續(xù)灌胃的7天中，腹瀉組小鼠出現(xiàn)消瘦、體重減輕癥狀，而對照組小鼠均未出現(xiàn)腹瀉、消瘦及體重減輕

7、的癥狀。通過計數(shù)灌胃后12h內(nèi)糊狀便及水樣便次數(shù)，可發(fā)現(xiàn)腹瀉組小鼠出現(xiàn)糊狀便及水樣便的次數(shù)較對照組相比明顯增多（8.57±0.1VS0±0.0，p<0.05），差別具有統(tǒng)計學意義。2.80mg/kg小檗堿灌胃后，腹瀉癥狀得到很好的控制，小檗堿處理組小鼠未出現(xiàn)腹瀉、消瘦及體重減輕的癥狀。連續(xù)灌胃7天，通過計數(shù)灌胃后12h內(nèi)糊狀便及水樣便次數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)小檗堿處理組小鼠出現(xiàn)糊狀便及水樣便的次數(shù)明顯少于腹瀉組（0.14±0.05VS8.57±0

8、.1,p<0.05），具有統(tǒng)計學意義。3.RT-PCR結(jié)果顯示NHE1、NHE2、NHE3、AQP4、AQP8、AE1、CFTR和SGLT1在小鼠近端結(jié)腸上皮細胞均存在一定程度的表達。與空白對照組小鼠相比，腹瀉組小鼠NHE1、NHE2、NHE3、AQP4、AQP8、CFTR和SGLT1的表達明顯下調(diào)，而AE1的表達沒有顯著性變化。與腹瀉組小鼠相比，小檗堿處理組小鼠NHE2、NHE3、AQP4和AQP8的表達明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計學意義（P<

9、0.05），而NHE1、CFTR和SGLT1的表達沒有顯著性變化。4.免疫組化結(jié)果顯示NHE3和AQP4蛋白主要表達于近端結(jié)腸上皮刷狀緣，腹瀉組小鼠NHE3和AQP4蛋白呈少量表達乃至陰性表達，而接受小檗堿處理的小鼠，其近端結(jié)腸上皮細胞NHE3和AQP4蛋白呈中度表達。5.在人腸上皮細胞系HIEC，RT-PCR結(jié)果表明，與單用番瀉苷A處理相比，番瀉苷A和小檗堿共處理的HIEC細胞，其NHE3mRNA的表達水平上調(diào)了約2倍，同樣AQP4的