1、分類號：墨塑2 ：!密級：公玨 學號：—2 0 1 4 9 1 —3 0 6 5 4A C L S V 蘋果植株體內(nèi)分布及互作基因P R l 0 超表達、R N A i 載體構建D i s t r i b u t i o n o f A C L S V i na p p l e t r e ea n d o v e r - e x p r e s s i o na n d R N A i v e c t o r c o n s t r

2、u c t i o n o f P R l 0學位申請人：丁麗指導教師：王亞南副教授曹克強教授學位名稱：農(nóng)業(yè)推廣碩士研究領域：植物保護授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學答辯日期：二。一六年六月二日摘要蘋果褪綠葉斑病毒( A p p l ec h l o r o t i cl e a f s p o tv i r u s ，A C L S V ) 是世界性分布最廣的一類蘋果潛隱性病毒，該病毒會導致樹體衰弱、產(chǎn)生慢性病害，嚴重影響果樹的生長發(fā)育。繁育無

3、毒苗木是目前蘋果病毒病害最為有效的防治措施。但A C L S V 在常規(guī)品種上不表現(xiàn)明顯癥狀，加之樹體大、病毒含量受氣候因素影響，在不同生育期病毒在樹體內(nèi)分布不均，影響了病毒的檢測效率。因此，了解病毒在植株體內(nèi)的分布規(guī)律是準確診斷的前提，也是果樹無毒栽培的基本保障。本研究利用實時熒光定量R T - P C R技術，對蘋果不同生長發(fā)育時期、不同組織部位A C L S V 進行測定，揭示病毒分布規(guī)律，為A C L S V 的準確診斷及無毒苗

4、木生產(chǎn)奠定基礎。病程相關蛋白( P R ) 在植物抵御疾病、響應外界壓力以及適應不良環(huán)境方面發(fā)揮著重要作用。P R l 0 是目前唯一被證明與病毒互作的P R 成員。我們前期構建了蘇俄蘋果e D N A 文庫，篩選并證明了P R l 0 與A C L S V C P 、P 5 0 的互作，本研究進一步測定并分析了蘇俄蘋果P R l 0 序列，構建了P R l 0 過表達及R N A i 干涉載體，為探究A C L S V 與寄主互作機制

5、奠定了基礎。取得的具體研究結果如下：1 、A C L S V 實時熒光定量R T - P C R 檢測體系的建立及優(yōu)化對檢測體系進行了建立和優(yōu)化。測定了內(nèi)參基因和病毒基因引物特異性，確定病毒特異性引物最佳引物濃度為1 0g m o l ／L 、最佳退火溫度為5 7 ℃，優(yōu)化后的檢測體系靈敏度為1 0 - 6 模板稀釋液，并且驗證了該方法在田間檢測中的可靠性。2 、A C L S V 在蘋果植株體內(nèi)的分布采用實時熒光定量R T - P C

6、 R 技術，對2 0 1 5 年9 月中旬至2 0 1 6 年4 月中旬蘋果樹體內(nèi)A C L S V 基因相對表達量進行了測定。從組織部位、樹體方位和生長發(fā)育時期3個角度對病毒含量變化進行了分析，結果表明： ( 1 ) 從組織部位角度分析，在蘋果的盛花期，A C L S V 在花中的含量最高，葉最低，A C L S V 含量由高到低的順序依次為：花、兩年生枝條樹皮組織、芽、一年生枝條樹皮組織和葉。 ( 2 ) 從樹體方位角度分析，在蘋果

7、一年生枝條樹皮組織中，A C L S V 在4 個方位上的病毒含量差異比較顯著，位于南向的病毒含量最高，西向最低。 ( 3 ) 從生長發(fā)育時期角度進行分析，蘋果一年生枝條樹皮組織中，病毒含量是從9 月中旬到1 0 月中旬大幅度升高，1 0 月中旬達到這8 個月份中的最高峰，此后病毒含量開始下降，3 月起呈上升趨勢。3 、蘇俄蘋果P R l 0 分子克隆及序列分析以蘇俄蘋果組培苗為材料，R T - P C R 擴增P R l 0 基因片段

8、，進行分子克隆及序列分析。結果表明，測得的蘇俄蘋果P R l 01 1 條序列，有效序列分為4 種：蘇俄P R l 0 —1 1為一種，G e n B a n k 登錄號為K X 2 4 9 5 9 4 ；P R l 0 ．1 6 為一種，G e n B a n k 登錄號為K x 2 4 9 5 9 5 ：P R l 0 —3 和P R l 0 ．1 5 一l 相同，G e n B a n k 登錄號為K x 2 4 9 5 9 6

9、；P R l 0 。2 、P R l 0 —5 、P R l 0 —7 、P R l 0 —1 3 、P R l 0 —1 5 序列相同，G e n B a n k 登錄號為K X 2 4 9 5 9 7 。我們選擇了所占比例最多的一種，作為后續(xù)基因超表達和R N A i 載體構建的對象。4 、蘇俄蘋果P R l 0 過表達及R N A i 干涉載體的構建以蘇俄蘋果P R l 0 家族中最常見的P R I O ( 登錄號為：K X 2