1、目的:當前糖尿病腎病(Diabetic nephropahty,DN)已成為導致終末期腎病維持性透析的主要病因,給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力。糖尿病腎病主要病理特征是腎小球系膜細胞肥大、細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)堆積進而發(fā)生腎小球硬化。Megsin是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一種在腎小球系膜細胞優(yōu)勢表達基因,其表達產(chǎn)物屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor,ser

2、pin),因此而命名(mesangialcell-predominant gene with a homology to serpin)。Serpin的作用包括凝血、纖維蛋白溶解、細胞外基質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細胞分化、增殖和凋亡等。已有研究發(fā)現(xiàn),其在以系膜細胞增生、系膜基質(zhì)積聚為主要病理改變的糖尿病腎病中,其基因與蛋白表達水平顯著上調(diào)。Megsin基因與蛋白的表達上調(diào)在糖尿病腎病發(fā)病機制中的作用目前已受到國內(nèi)外學者的關(guān)注。高糖環(huán)境下系膜細

3、胞中p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路可被激活,進而使TGF-β1、炎癥因子等表達上調(diào);且PDGF-BB可能通過p38MAPK通路作用于腎小球系膜細胞,抑制細胞外基質(zhì)的降解,促進細胞外基質(zhì)如Ⅳ型膠原、FN的合成,從而參與腎小球硬化的過程。但在高糖刺激轉(zhuǎn)染Megsin基因的系膜細胞是否會通過p38MAPK通路進而影響氧化應(yīng)激及炎癥因子的產(chǎn)生,促進DN的發(fā)展,目前國內(nèi)外尚無研究。
　　 本課題通過轉(zhuǎn)染Megsin基因,觀察高糖環(huán)境中腎臟系膜

4、細胞megsin、p-p38絲裂酶原蛋白激酶(p-p38MAPK)、細胞間粘附因子(ICAM-1)、巨噬細胞趨化蛋白(MCP-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)等表達的變化,以及通過轉(zhuǎn)染Megsin siRNA基因,觀察megsin低表達時高糖環(huán)境中腎臟系膜細胞上述各因子的表達情況,從而探討megsin在糖尿病狀態(tài)下系膜細胞中的作用機制,進一步尋找糖尿病腎病早期干預(yù)的新靶點,為人類早期防

5、治糖尿病腎病提供實驗性的理論依據(jù)。
　　 方法:建立穩(wěn)定表達megsin的小鼠系膜細胞株(M組),應(yīng)用脂質(zhì)體2000瞬時轉(zhuǎn)染megsin siRNA質(zhì)粒系膜細胞(S組),同時設(shè)立野生型小鼠系膜細胞正常糖培養(yǎng)組(N組)、高糖培養(yǎng)組(D組)和空質(zhì)粒對照+高糖培養(yǎng)組(V組),高糖環(huán)境中培養(yǎng)48小時,分別于12、24和48小時末收集各組細胞及上清,提取蛋白,應(yīng)用western blot測定各組總蛋白中megsin、p-p38、ICAM-

6、1、MCP-1的表達,比色法檢測細胞培養(yǎng)液中SOD、GSH-PX、MDA含量的變化。免疫細胞化學染色,檢測上述指標的表達,光鏡下觀察megsin、p-p38、ICAM-1、MCP-1等各項指標的陽性表達情況并進行定位、定性及半定量分析,結(jié)果用均數(shù)±標準差(x±s)表示,組間差異性比較采用單因素方差分析和q檢驗,顯著性水平等于0.05,應(yīng)用SPSS15.0軟件包對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。
　　 結(jié)果:1 western blot結(jié)

7、果:western blot顯示在12h、24h、48h各時間點系膜細胞megsin、p-p38、ICAM-1、MCP-1蛋白表達水平N組、S組、D組、M組依次升高,組間比較差異有顯著性(P＜0.05),D組和V組相比差異無顯著性(P＞0.05);
　　 2細胞上清SOD、GSH-PX、MDA檢測結(jié)果:在12h、24h、48h各時間點,N組、S組、D組、M組小鼠系膜細胞上清液中SOD、GSH-PX活性依次下降,組間比較差異有顯著

8、性(P＜0.05),D組和V組相比差異無顯著性(P＞0.05),而N組、S組、D組、M組小鼠系膜細胞上清液中MDA活性依次上升,組間比較差異有顯著性(P＜0.05),D組和V組相比差異無顯著性(P＞0.05);
　　 3免疫細胞化學結(jié)果:免疫細胞化學染色顯示megsin、ICAM-1及MCP-1主要在系膜細胞胞漿表達。高糖培養(yǎng)小鼠系膜細胞在12h、24h、48h各時間點上述各因子的表達水平N組、S組、D組、M組依次增強,組間比較

9、差異有顯著性(P＜0.05)。D組和V組相比差異無顯著性(P＞0.05)。P-p38主要在系膜細胞胞核中表達,上述各時間點表達情況N組、S組、D組、M組依次增強,組間比較差異有顯著性(P＜0.05),D組和V組相比差異無顯著性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:1高糖環(huán)境下培養(yǎng)的系膜細胞中megsin的表達上調(diào),且呈時間依賴性。
　　 2過表達megsin可上調(diào)系膜細胞p-p38、ICAM-1及MCP-1的表達,提示megs

10、in可能促發(fā)高糖環(huán)境中系膜細胞增殖和氧化應(yīng)激的發(fā)生,這與p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路及其下游炎癥因子的激活存在密切相關(guān)性。
　　 3通過megsin siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染下調(diào)megsin表達的同時高糖培養(yǎng)腎小球系膜細胞中p-p38、ICAM-1及MCP-1的表達亦下調(diào),提示抑制megsin的表達可以通過抑制p38MAPK途徑減輕高糖環(huán)境下系膜細胞的損傷,是早期防治糖尿病腎病的有效途徑,為篩選防治糖尿病腎病的新靶點提供了實驗性理論依據(jù)