1、目的:腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)似乎參與嚙齒類動物的心臟纖維化過程,表現(xiàn)為非上皮細胞的增殖和細胞外基質(zhì)的改變,且在許多實驗研究中高濃度葡萄糖同樣可以促進心臟成纖維細胞的增殖。但高濃度葡萄糖和醛固酮對心臟成纖維細胞的增殖是否具有協(xié)同作用,結(jié)論并不一致。因此本研究以新生SD大鼠的心臟成纖維細胞為模型,研究不同葡萄糖濃度和醛固酮對新生大鼠心臟成纖維細胞增殖的影響,為心臟纖維化的發(fā)生提供新的認識。
　　 方法:
　　 1實驗動

2、物:出生1-3d的SD大鼠,雌雄不限,購于河北醫(yī)科大學(xué)動物動中心。
　　 2心臟成纖維細胞的培養(yǎng):無菌條件下取出生1-3天的SD大鼠心臟,胰蛋白酶消化心臟組織后取消化液,經(jīng)過濾、離心將所得細胞種植于含培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,將培養(yǎng)瓶放在5％CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育40分鐘后,棄去上層培養(yǎng)液和未貼壁細胞,所得細胞基本為成纖維細胞。更換培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),每隔一天換培養(yǎng)液.當(dāng)細胞生長至亞融合狀態(tài)時,以1×105/ml密度傳代,實驗所用細胞均

3、為第二代細胞。
　　 3免疫組織化學(xué)觀察:取24孔板,每孔內(nèi)放一片蓋玻片,將心臟成纖維細胞接種于孔內(nèi)蓋玻片上,置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞充分附著貼壁后,取出蓋玻片用PBS液清洗兩遍,4％多聚甲醛固定,按免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶(ABC)法進行免疫細胞化學(xué)染色并于顯微鏡下觀察。
　　 4實驗分組:將生長狀態(tài)一致、處于對數(shù)生長期的第二代細胞隨機分為九組:
　　 (1)低糖組(5.6 mmol/L

4、D-葡萄糖)
　　 (2)低糖+10-7mol/L醛固酮(Ald)組
　　 (3)低糖+10-7mol/L Ald+10-6mol/L螺內(nèi)酯(Spi)
　　 (4)高糖A組(15 mmol/L D-葡萄糖)
　　 (5)高糖A+10-7mol/L Ald組
　　 (6)高糖A+10-7mol/L Ald+10-6mol/L Spi
　　 (7)高糖B組(25 mmol/L D-葡萄糖)

5、r>　　 (8)高糖B+10-7mol/L Ald組
　　 (9)高糖B+10-7mol/L Ald+10-6mol/L Spi
　　 各組的培養(yǎng)液均為無血清等滲培養(yǎng)液。
　　 5 Brdu、WST-1 ELISA法同步測定心臟成纖維細胞的DNA合成和代謝活性:
　　 將生長良好的第一代細胞消化、收集、記數(shù),調(diào)整濃度后接種于96孔板,每孔5000-6000個細胞。37℃、5％CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24小

6、時,棄去各孔培養(yǎng)液,以無血清低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時,使細胞進入靜止生長期。采用三種D-葡萄糖濃度培養(yǎng)液(5.6 mmol/L,15 mmol/L,25 mmol/L)、醛固酮(10-7mol/L)及螺內(nèi)酯(10-6 mol/L)干預(yù)24小時,其中用L-葡萄糖調(diào)節(jié)三種培養(yǎng)液使其滲透壓相等。按試劑盒說明書采用WST-1、Brdu摻入法同步測定心臟成纖維細胞的DNA合成和代謝活性。
　　 6統(tǒng)計學(xué)處理:
　　 實驗數(shù)據(jù)

7、用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析,結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,組與組之間分析采用多組均數(shù)的兩兩比較。交互作用采用兩因素方差分析,P＜0.05表示有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1心臟成纖維細胞的鑒定:免疫細胞化學(xué)染色,光鏡下見細胞呈梭形或多角形,纖維連接蛋白染色呈陽性,胞漿內(nèi)圍繞胞核呈現(xiàn)棕黃色細密顆粒,呈細絲狀,PBS對照呈陰性,符合成纖維細胞的染色特征。免疫組化抗波形蛋白、

8、纖維連接蛋白染色陽性鑒定為所需的心肌成纖維細胞,純度達94％。
　　 2不同糖濃度對成纖維細胞增殖的影響:WST-1和Brdu結(jié)果表明,與低糖組(5.6 mmol/L)比較,高糖組(15 mmol/L、25 mmol/L)細胞的代謝活性和DNA合成均顯著增高(P＜0.01)。但高糖兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3醛固酮在不同糖濃度時對成纖維細胞增殖的影響:WST-1和Brdu結(jié)果表明,與低糖組(5.6mmol/L)比

9、較,低糖+10-7mol/L醛固酮組細胞的代謝活性和DNA合成均明顯增高(WST-1,P＜0.01;Brdu,P=0.019)。但高糖(A、B)+10-7mol/L醛固酮組與對應(yīng)的高糖(A、B)組比較差別均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4螺內(nèi)酯對醛固酮刺激成纖維細胞增殖的影響。
　　 WST-1和Brdu結(jié)果表明,在不同糖濃度,與加醛固酮組比較,螺內(nèi)酯均能顯著抑制醛固酮引起的細胞代謝活性增強(P＜0.05),但對

10、DNA合成的抑制并不明顯(P＞0.05)。
　　 5糖和醛固酮對成纖維細胞增殖的交互作用。
　　 WST-1和Brdu結(jié)果表明,不同糖濃度對成纖維細胞代謝活性和DNA合成的影響不同(P＜0.01);10-7mol/L醛固酮對成纖維細胞代謝活性的影響有顯著性差異(WST-1,P＜0.05),但其對成纖維細胞DNA合成的影響不明顯(Brdu,P＞0.05);兩者對成纖維細胞代謝活性的交互作用不明顯(WST-1,P=0.085