1、目的:
　　 1.檢測三種常見肝細(xì)胞系免疫相關(guān)分子的表達(dá)模式；
　　 2.比較不同復(fù)制水平的HBV 對(duì)不同肝細(xì)胞系天然免疫相關(guān)分子表達(dá)的影響；
　　 3.探索HepG2與HepG2.2.15細(xì)胞IL-10的表達(dá)差異及可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測不同肝細(xì)胞系（HepG2，HepG2.2.15，Huh7）免疫相關(guān)分子的表達(dá)情況。
　　 2.HBV 可復(fù)制質(zhì)粒pH

2、BV1.3和pBS-HBV1.3分別轉(zhuǎn)染HepG2和Huh7細(xì)胞，realtime RT-PCR檢測天然免疫相關(guān)基因TLRs、RLRs等的表達(dá)；CMIA 法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清中抗原表達(dá)水平；real time RT-PCR檢測上清中HBV DNA水平。
　　 3.PCR及測序鑒定HepG2.2.15細(xì)胞中IL-10 mRNA的表達(dá)；ELISA 檢測進(jìn)一步證實(shí)HepG2.2.15細(xì)胞上清中IL-10 蛋白的表達(dá)；在利用抗病毒干預(yù)處

3、理和HBVsiRNA、IL-10siRNA 轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后，real time PCR檢測細(xì)胞上清中HBV DNA及細(xì)胞IL-10 mRNA表達(dá)變化，CMIA 檢測HBsAg與HBeAg的表達(dá)，ELISA 檢測IL-10蛋白的表達(dá)。
　　 4.各種處理后real-time PCR、western blot 檢測STAT1、MyD88、NF-κB分子在HepG2.2.15細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果:

4、　　 1.RT-PCR結(jié)果顯示：HepG2、HepG2.2.15、Huh7 三種肝細(xì)胞系能表達(dá)一系列的免疫相關(guān)分子，其中HBV 穩(wěn)定復(fù)制的HepG2.2.15細(xì)胞與HepG2 相比，表達(dá)上調(diào)的有：TGF-β1、IL-10、IL-10R、TNFR、HLA-A、MICB；而表達(dá)下調(diào)的有：IL-7、IL-15、IL-12p35、IL-15R、HLA-B、RIG1、A20、DUBA。其中有趣是IL-10 僅在HepG2.2.15細(xì)胞中檢測到表

5、達(dá)。
　　 2.不同可復(fù)制性HBV 克隆轉(zhuǎn)染不同肝細(xì)胞系后表現(xiàn)出不同的HBV 復(fù)制能力，pBS-HBV1.3 質(zhì)粒無論在HepG2 還是Huh7中其病毒DNA水平及抗原水平均明顯低于pHBV1.3 質(zhì)粒，且不同復(fù)制能力的HBV 對(duì)兩種肝細(xì)胞系天然免疫相關(guān)分子表達(dá)模式的影響也不一樣。
　　 3.HepG2.2.15細(xì)胞可以分泌表達(dá)IL-10，但pHBV1.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不能誘導(dǎo)HepG2表達(dá)IL-10，提示IL-10的表達(dá)可

6、能與HBV 瞬時(shí)表達(dá)無關(guān)而與HBV 持續(xù)復(fù)制相關(guān)。
　　 4.IL-10-siRNA 轉(zhuǎn)染HepG2.2.15后，抑制了IL-10 蛋白及mRNA的表達(dá)，但對(duì)HBV的表達(dá)無明顯影響。
　　 5.HBVsiRNA 質(zhì)粒能抑制HepG2.2.15細(xì)胞系HBV 抗原及HBV DNA水平，但對(duì)HBV DNA的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBVsiRNA 可下調(diào)IL-10的蛋白水平。
　　 6.拉米夫定可顯著降低HepG2.2.1

7、5細(xì)胞HBV 抗原表達(dá)及HBV DNA復(fù)制水平，同時(shí)下調(diào)IL-10的表達(dá)及mRNA 轉(zhuǎn)錄。但其它非特異性抗病毒免疫制劑的處理對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制水平的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除了poly(IC)升高IL-10的蛋白水平，其他處理不同程度的降低了IL-10的蛋白水平，但對(duì)NF-κB和MyD88的表達(dá)均沒有明顯影響。所有處理均影響STAT1的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.HepG2、HepG2.2.15

8、、Huh7 三種肝細(xì)胞系能表達(dá)一系列的免疫相關(guān)分子，且不同肝細(xì)胞系的表達(dá)模式存在一定的差異，這些差異主要出現(xiàn)在HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞之間，而HepG2與Huh7 之間最大的差異是前者不表達(dá)TLR7，最有意思的是僅HepG2.2.15細(xì)胞檢測到IL-10的表達(dá)。
　　 2.HBV在肝細(xì)胞系中的復(fù)制影響了一些天然免疫相關(guān)分子的表達(dá)。pBS-HBV1.3質(zhì)粒在肝細(xì)胞系中的HBV 復(fù)制能力較pHBV1.3 低，不同程度

9、的HBV 復(fù)制對(duì)肝細(xì)胞系天然免疫相關(guān)分子表達(dá)的影響之間有一定的差異。
　　 3.HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)IL-10，但其表達(dá)和調(diào)控機(jī)制是不依賴于NF-κB、MyD88和HBV DNA水平的，STAT1 途徑可能參與了HepG2.2.15細(xì)胞中IL-10的表達(dá)調(diào)控，但并非唯一途徑?；罨疶LR3 途徑可能參與了該細(xì)胞系中IL-10的表達(dá)調(diào)控，但這種調(diào)控是不依賴于HBV DNA、NF-κB和MyD88的，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

10、
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn):
　　 1.以HepG2、HepG2.2.15和Huh7 三種常見肝細(xì)胞系為研究對(duì)象探討了免疫相關(guān)分子在肝細(xì)胞系的表達(dá)情況，并通過用不同復(fù)制能力的HBV 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同肝細(xì)胞系后檢測不同時(shí)間點(diǎn)的天然免疫相關(guān)分子表達(dá)變化，動(dòng)態(tài)觀察了不同程度HBV 復(fù)制對(duì)肝細(xì)胞天然免疫相關(guān)分子表達(dá)模式的影響。
　　 2.發(fā)現(xiàn)常見肝細(xì)胞系中僅HBV 穩(wěn)定表達(dá)的HepG2.2.15細(xì)胞分泌表達(dá)IL-10，且HBV

11、瞬時(shí)表達(dá)不能誘導(dǎo)HepG2表達(dá)IL-10，并對(duì)這一重要免疫調(diào)控細(xì)胞因子在HepG2.2.15細(xì)胞系中表達(dá)的可能機(jī)制進(jìn)行了初步研究。
　　 本研究的意義:
　　 1.初步探討了不同肝細(xì)胞系作為HBV 體外復(fù)制模型及不同程度HBV 復(fù)制對(duì)肝細(xì)胞系天然免疫相關(guān)分子表達(dá)影響的差異，為HBV 復(fù)制對(duì)肝細(xì)胞免疫分子表達(dá)影響的細(xì)胞模型的選擇提供了一定的依據(jù)，也為HBV 感染后肝臟免疫的可能機(jī)制提供了一定的依據(jù)。
　　 2.對(duì)I