1、目的：目前關(guān)于HBx蛋白的研究多在永生化或轉(zhuǎn)化細胞中進行，由于不同的研究體系得出的結(jié)論有所差異，所以我們以原代培養(yǎng)小鼠肝細胞作為研究系統(tǒng)，模擬正常的細胞環(huán)境，探討HBV復制過程中HBx蛋白對原代小鼠肝細胞周期的影響，以期闡釋HBx蛋白對HBV復制的影響機制。
　　方法：(1)培養(yǎng)原代小鼠肝細胞并用Western blot檢測周期蛋白的表達水平。(2)采用野生型HBV編碼質(zhì)粒(pHBV)和HBx蛋白表達缺失的HBV編碼質(zhì)粒(pHBV

2、△x)分別轉(zhuǎn)染原代肝細胞。(3)Western blot檢測轉(zhuǎn)染后兩組細胞的周期蛋白表達水平。(4)Southern blot檢測兩組細胞的HBV DNA復制水平。(5)Real-time PCR檢測兩組細胞的HBV DNA復制水平。
　　結(jié)果：(1)新鮮分離的肝細胞和原代培養(yǎng)24、48、72h的肝細胞的細胞周期蛋白表達水平無明顯差異。(2)轉(zhuǎn)染48h后，pHBV組細胞與pHBV△X組細胞周期蛋白條帶灰度值相比，前者cyclin

3、D1、p21、cyclin E表達量較高，p16的表達量較低，統(tǒng)計量t值分別為15.713，22.897，14.680，-19.584，P值均< 0.05。(3)培養(yǎng)72 h后提取HBV DNA，Southern blot檢測HBV DNA復制中間體松散環(huán)狀DNA、雙鏈線性DNA、單鏈DNA的水平，經(jīng)條帶灰度掃描，pHBV組的水平（分別為3288.336 ± 448.011、6458.318 ± 182.163、2760.613 ± 3

4、93.561）明顯高于pHBV△X組（分別為515.721 ± 62.530、2122.228 ± 28.347、1632.013 ± 207.021）及空白對照組，P值均< 0.05；(4)實時熒光定量PCR檢測HBV DNA復制水平，pHBV組 [每個細胞（987.50 ± 47.80）拷貝]也明顯高于pHBV△X組 [每個細胞（303.67 ± 33.94）拷貝]，t = 20.203，P < 0.05。
　　結(jié)論：HBx蛋