1、目的:將乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)X蛋白真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞,觀察X蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)及其對巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及凋亡的影響,為進(jìn)一步研究HBV的致病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:用Primer5.0軟件分析HBV X基因序列,設(shè)計(jì)相應(yīng)特異性引物,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增465bp的目的基因片段,將其插入pcDNA3.1(+)載體,通過雙酶切分析及測序鑒定篩選陽性

2、重組體;將真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx通過Super FectTM脂轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞,利用 Western-blotting鑒定X蛋白在巨噬細(xì)胞中的表達(dá);細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24h,用LPS刺激巨噬細(xì)胞,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測pcDNA3.1(+)-HBx轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞不同時間(12h、24h、48h)培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的含量,統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析所得數(shù)據(jù);通過形態(tài)學(xué)方法觀察巨噬細(xì)

3、胞,利用顯微計(jì)數(shù)法測定X蛋白即時高表達(dá)時,地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡率,用統(tǒng)計(jì)軟件通過方差分析所得數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　(1)將PCR擴(kuò)增的465bp大小的HBV X基因片段,連接入pcDNA3.1(+),雙酶切及測序結(jié)果表明X基因亞克隆入pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體,即得 X蛋白真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx。
　　(2)將真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HBx轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞,Wester

4、n-blotting結(jié)果顯示pcDNA3.1(+)-HBx能在巨噬細(xì)胞中表達(dá)約17KD的目的蛋白。
　　(3)ELISA法測定細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量,LPS刺激組及pcDNA3.1(+)組與空白對照組有顯著性差異(P<0.01),pcDNA3.1(+)-HBx組與LPS刺激組及pcDNA3.1(+)組有顯著性差異(P<0.01),而LPS刺激組與pcDNA3.1(+)組無顯著性差異(P>0.05),即LPS可活化

5、巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,且X蛋白即時高表達(dá)可引起LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β明顯增加。
　　(4)地塞米松誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,地塞米松刺激組及pcDNA3.1(+)組與空白對照組有顯著性差異(P<0.05),pcDNA3.1(+)-HBx組與pcDNA3.1(+)組及地塞米松刺激組有顯著性差異(P<0.05),而地塞米松刺激組與pcDNA3.1(+)組無顯著性差異(P>0.05),即地塞米松能高