1、研究背景:
　　 急性白血病是一類嚴(yán)重危害兒童健康的腫瘤性疾病,根據(jù)增生的白細(xì)胞種類不同,分為急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)和急性髓細(xì)胞白血病(acute myelogenous leukemia,AML)兩大類。其中AML約占兒童急性白血病的25～30％,除急性早幼粒細(xì)胞白血病外,余各型化療效果、緩解率及5年無(wú)病生存率均較差。因此開(kāi)發(fā)新的AML治療方法,改善AML患兒的預(yù)后,

2、成為兒科血液工作者亟待解決的課題。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)是近年發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)的一類轉(zhuǎn)錄因子。NF-κ3家族有5個(gè)成員,彼此結(jié)合以同源或異源二聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,其中由p50和p65亞基組成的異源二聚體p50／p65是發(fā)現(xiàn)時(shí)間最早、分布最為廣泛、主要發(fā)揮作用的一類核轉(zhuǎn)錄因子,可與多種啟動(dòng)子和／或增強(qiáng)子的序列特異性結(jié)合,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的發(fā)生,在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)

3、及細(xì)胞增殖與凋亡等病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn),NF-κB的不適當(dāng)激活與血液系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞耐藥密切相關(guān),對(duì)NF-κB進(jìn)行調(diào)控目前已經(jīng)成為抗腫瘤治療的熱點(diǎn)。
　　 近年,新興的RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)為進(jìn)一步研究NF-κB的功能提供了技術(shù)支持。RNAi是指通過(guò)人為方式將與內(nèi)源性mRNA互補(bǔ)的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞,引

4、起特定mRNA的降解,編碼的基因不能表達(dá),引發(fā)相應(yīng)基因沉默的技術(shù),具有高效、特異性、細(xì)胞毒性低等特點(diǎn),也是基因治療的方法之一。
　　 急性單核細(xì)胞白血病是兒童AML中化療緩解率、預(yù)后差的幾種類型之一,主要表現(xiàn)為異常的原始及幼稚單核細(xì)胞的惡性增殖及凋亡受抑。本課題組前期試驗(yàn)證實(shí),在兒童急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株THP-1中有NF-κB的持續(xù)激活。設(shè)想可通過(guò)RNAi技術(shù)抑制NF-κB的表達(dá),促進(jìn)THP-1細(xì)胞的凋亡,在體外研究中為AM

5、L的基因治療提供一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。
　　 研究目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用特異性NF-κB p65 siRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞,觀察其對(duì)THP-1細(xì)胞增殖與凋亡的影響及可能機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 體外培養(yǎng)THP—1細(xì)胞,將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行分組:①空白對(duì)照組,使用PBS液處理細(xì)胞；②陰性對(duì)照組,即NC組,應(yīng)用control siRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞；③實(shí)驗(yàn)組,應(yīng)用NF-κB p65 s

6、iRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞。采用半定量RT-PCR及Western Blot方法分別檢測(cè)p65、CyclinD1及IκBα的基因及蛋白的表達(dá),末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)、AnnexinV／PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡,CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1.Control siRNA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞的效率
　　 應(yīng)用熒光素標(biāo)記的control siRNA—FITC轉(zhuǎn)染

7、THP—1細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染24小時(shí)的效率最高,達(dá)60％以上。
　　 2.NF-κB p65 siRNA干擾效應(yīng)的檢測(cè)
　　 RT-PCR.結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組p65 mRNA表達(dá)明顯減低,以48小時(shí)作用最為明顯,抑制率達(dá)(75.52±4.02)％,而空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組則無(wú)明顯改變；Western Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48小時(shí),空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中p65蛋白相對(duì)含量依次為2.41±

8、0.11、2.33±0.09、0.82±0.10,p65 siRNA干擾組明顯減低(P<0.01),對(duì)蛋白抑制率達(dá)(74.68±5.27)％。表明NF-κB p65 siRNA可有效地干擾了p65 mRNA及蛋白的表達(dá),于48小時(shí)干擾效應(yīng)最明顯。
　　 3.NF-κB p65 SiRNA對(duì)CyclinD1mRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　 RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,實(shí)驗(yàn)組CyclinD1

9、 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯減低,而空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組則無(wú)明顯改變。表明NF-κBp65 siRNA可有效抑制CyclinD1 mRNA及蛋白表達(dá)。
　　 4 NF-κB p65 siRNA對(duì)IκBαmRNA及蛋白表達(dá)的影響
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,干擾48小時(shí),實(shí)驗(yàn)組IκBαmRNA表達(dá)增加,表達(dá)率達(dá)(1.25±0.05),而空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組則無(wú)明顯改變；Western Blot結(jié)果顯示空白對(duì)照組、陰性對(duì)照

10、組及實(shí)驗(yàn)組中IκBα蛋白表達(dá)依次為0.76±0.06、0.81±0.02、1.14±0.06,p65 siRNA干擾組明顯升高(P<0.01)。表明NF-κB p65 siRNA作用后IκBα表達(dá)增加。
　　 5 NF-κB p65 siRNA對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響
　　 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48小時(shí),實(shí)驗(yàn)組THP-1細(xì)胞凋亡率(8.49±0.14)％較空白組(2.77±0.46)％及陰性對(duì)照組(2.88±0.61

11、)％顯著增加(P<0.05),TUNEL方法結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48小時(shí),實(shí)驗(yàn)組THP-1細(xì)胞凋亡率(16.47±1.75)％較空白組(4.30±1.47)％及陰性對(duì)照組(3.69±0.86)％％著增加(P<0.05)。
　　 6 NF-κB p65 siRNA干擾對(duì)THP-1細(xì)胞增殖的影響
　　 CCK-8結(jié)果顯示:與空白組及陰性對(duì)照組相比較,NF-κB p65 siRNA作用的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度在第2天速度明顯減慢,缺乏指數(shù)