1、研究背景: 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起嚴重肝臟疾病的病原體之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球20多億人曾感染乙肝病毒，其中約3.5億人為慢性乙肝病毒感染者。慢性乙肝不易徹底治愈，并隨著病情發(fā)展可惡化成肝硬化、肝癌。自1965年Blumberg等發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒表面抗原，到1997年病毒全基因組的克隆和測序完成，人們對HBV的基因組成和抗原的結構、生物特性及其生命周期的認識迅速發(fā)展。但因缺乏體外增

2、殖系統(tǒng)和易獲得的細胞模型，HBV感染肝臟的早期機理研究進展較為緩慢，從而在一定程度上影響乙型肝炎及其相關肝臟疾病的基礎和臨床研究。由于人的肝組織來源有限，而且HBV病毒粘附以及DNA轉錄和復制對宿主有嚴格的限制，先前研究過的細胞模型又各存在其不可避免的缺陷。因此，建立一個近于自然感染狀態(tài)即既適用于轉染又可用血清中病毒顆粒直接感染，接近肝細胞生理狀態(tài)并能穩(wěn)定表達HBV抗原的細胞模型是急需的。 本研究旨在通過將利用化學誘變劑誘導產(chǎn)生

3、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)基因突變的HepG2細胞與人原代肝細胞融合，建立雜交細胞株，這個雜交細胞株從細胞基因工程學理論上講應該具有雙親遺傳學特性，即既具有人原代肝細胞對HBV易感的特性又具有HepG2細胞能體外長期傳代的特性。并對HBV在該雜交細胞的感染情況進行初步研究。 目的: 建立不同于HepG2細胞及人原代肝細胞的新型雜交細胞株，使該細胞株既能長期攜帶HBV又能體外傳代培養(yǎng)。 方法:

4、 誘導HepG2細胞產(chǎn)生HGPRT基因突變，將篩選出的HGPRT缺陷的HepG2細胞與攜帶HBV的人原代肝細胞進行融合得雜交細胞，用HAT培養(yǎng)基篩選出異核體雜交細胞，再利用有限稀釋法進行克隆，通過核型分析方法鑒定所得細胞。對所得雜交細胞及培養(yǎng)上清液進行HBV DNA和HBsAg、HBeAg的檢測。實驗同時，用未雜交的HepG2細胞和人原代肝細胞作對照。 結果: 經(jīng)篩選后，有一雜交細胞株(HepCHLine3)克隆成功。

5、HepCHLine3在形態(tài)學上與HGPRT缺陷HepG2細胞相似，能體外傳代培養(yǎng)，染色體核型分析示HepCHLine3雜交細胞染色體眾數(shù)為99條，證明為融合細胞株，含所有來自HepG2細胞和人原代肝細胞的基因數(shù)。傳代培養(yǎng)的HepCHLine3及其培養(yǎng)上清液用巢式PCR可分別檢測到HBV DNA，培養(yǎng)上清液內檢測到HBsAg和HBeAg。對照組的HepG2細胞和人原代肝細胞相應結果為陰性。結果提示該細胞攜帶并分泌HBV DNA。