1、目的：本研究意在通過骨髓基質(zhì)細(xì)胞與Ph+白血病細(xì)胞共培養(yǎng)模擬骨髓微環(huán)境，探討骨髓微環(huán)境是否通過VE-cadherin/β-catenin信號通路調(diào)控Ph+白血病細(xì)胞生物學(xué)行為和藥物敏感性的作用。
　　方法：1、建立體外模擬骨髓造血微環(huán)境模型：應(yīng)用OP9或人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(HBMSCs)與Ph+白血病細(xì)胞(K562或SUP-B15細(xì)胞)共培養(yǎng)。2、評價(jià)共培養(yǎng)前后K562和SUP-B15細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR與We

2、stern blot檢測ALDH1、CD133、VE-cadherin轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)前后CD34+CD38-細(xì)胞比例；免疫組化檢測Ki-67陽性率評估細(xì)胞的增殖。3、通過CCK-8法檢測共培養(yǎng)前后伊馬替尼對白血病細(xì)胞增殖抑制率。4、共培養(yǎng)前后分別測定白血病細(xì)胞胞漿和胞核內(nèi)β-catenin水平；免疫共沉淀方法檢測β-catenin與VE-cadherin相互作用；Western blot檢測細(xì)胞核內(nèi)β-cate

3、nin水平評估β-catenin信號的活化。5、利用前期研究中通過RNA干擾(RNAi)制備的VE-cadherin低表達(dá)Ph+白血病細(xì)胞株(SUP-B15/shVEC和K562/shVEC)評價(jià)下調(diào)VE-cadherin在存在基質(zhì)細(xì)胞時(shí)對Ph+細(xì)胞伊馬替尼敏感性的影響；Western blot分析下調(diào)VE-cadherin細(xì)胞內(nèi)與核內(nèi)β-catenin蛋白水平的變化。
　　結(jié)果：1、共培養(yǎng)后白血病細(xì)胞生物學(xué)行為改變表現(xiàn)：經(jīng)熒光定

4、量PCR檢測共培養(yǎng)前后Ph+白血病細(xì)胞基因ALDH1，CD133表達(dá)量較單純培養(yǎng)的白血病細(xì)胞升高(P<0.05)，CD133蛋白表達(dá)量也較單純培養(yǎng)的白血病細(xì)胞升高；流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)后白血病細(xì)胞CD34+CD38-比例升高；免疫組化檢測共培養(yǎng)后Ki-67陽性細(xì)胞率增高(P<0.05)；2、共培養(yǎng)前后伊馬替尼作用48h后通過CCK-8法檢測白血病細(xì)胞增殖率表明：共培養(yǎng)后增殖率明顯高于單純培養(yǎng)組(P<0.05)。3、共培養(yǎng)前后分別從轉(zhuǎn)錄水

5、平和蛋白水平分別檢測VE-cadherin與β-catenin的表達(dá)水平，結(jié)果表明共培養(yǎng)后VE-cadherin轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)量均明顯增高，β-catenin胞內(nèi)和核內(nèi)蛋白水平均增高(P<0.05)，但mRNA水平無明顯變化。4、免疫共沉淀結(jié)果提示共培養(yǎng)后β-catenin更多的與VE-cadherin結(jié)合，提示VE-cadherin是基質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)定β-catenin的主要途徑。5、7-AAD拒染實(shí)驗(yàn)表明沉默VE-cadherin后K56