1、廠——————一一’，堡鰱蘭蘭————一E f f e c t so f p r o t e a s o m e i n h i b i t i o no nm i c r o t u b u l e - ．a(chǎn) s s o c i a t e dp r o t e i n t a up h o s p h o r y l a t i o n a n d t h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s mA

2、 T h e s i sS u b m i t t e d i nP a r t i a lF 銳圻l l m e n t o f t h e R e q u i r e m e n tF o r t h eM ．s ．D e g r e ei nZ o o l o g yB yC h a n g J u n l iP o s t g r a d u a t eP r o g r a mC o l l e g e o f L i f e

3、S c i e n c eC e n t r a l C h i n a N o r m a l U n i v e r s i t yS u p e r v i s o r ：L i a o X i a o m e iA c a d e m i c T i t l e ：A s s o c i a t eP r o f e s s o r S i g n a t u r eA p p r o v e dM a y ．2 0 1 1摘要

4、由過度磷酸化t a u 蛋白聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，N F T S ) 是阿爾茨海默病( A l z h e i m e r ’Sd i s e a s e ，A D ) 和與1 7 號(hào)染色體相關(guān)的額顳葉癡呆與帕金森病( P a r k i n s o n ’Sd i s e a s e ，P D ) 等t a u 相關(guān)疾病的主要神經(jīng)病理學(xué)特征之

5、一。但是到目前為止，導(dǎo)致t a u 蛋白過度磷酸化及形成N F T s 的機(jī)制尚未完全闡明。不僅t a u 蛋白的磷酸化，而且其泛素化也可促進(jìn)N F T s 的形成。泛素一蛋白酶體系統(tǒng)( u b i q u i t i n ．p r o t e a s o m es y s t e m ，U P S ) 通過E 3 泛素連接酶可將磷酸化的t a u 蛋白泛素化，同時(shí)蛋白酶體活性在t a u 相關(guān)疾病中降低，表明U P S 可能影響t a

6、 u 蛋白的過度磷酸化。此外，糖原合酶激酶一3 p ( g l y c o g e n s y n t h a s ek i n a s e - 3 p ，G S K - 3 1 3 ) 和蛋白激酶B ( p r o t e i nk i n a s eB ，P K ．B ／A k t ) 也在t a u 蛋白的異常磷酸化中起關(guān)鍵作用，A k t 是G S K ．3 D 的上游激酶，且熱休克蛋白9 0 ( h e a ts h o c

7、kp r o t e i n 9 0 ，H s p 9 0 ) 與A k t 兩者之間結(jié)合程度的變化可以調(diào)節(jié)A k t 蛋白含量和活性改變。因此本文用穩(wěn)定表達(dá)人t a u 4 4 1 異構(gòu)體的人腎母瘤細(xì)胞株( h u m a ne m b r y o m ck i d n e y 2 9 3 c e l l s ，H E K 2 9 3 ／t a u 4 4 1 ) 為基本材料，用2 0 S p r o t e a s o m e 特異

8、性抑制劑l a c t a c y s t i n 和蛋白質(zhì)合成抑制劑放線茵酮( c y c l o h e x i m i d e ，C H X ) 共同處理細(xì)胞2 4 h ，通過免疫印跡、免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)蛋白酶體活性抑制對(duì)t a u 蛋白相關(guān)位點(diǎn)磷酸化、蛋白激酶G S K ．3 B 、A k t 和熱休克蛋白的影響以及蛋白酶體與G S K ．3 p 和蛋白酶體與A k t 之間的相互作用關(guān)系，以探討蛋白酶體活性抑制導(dǎo)致t

9、 a u 蛋白過度磷酸化的可能機(jī)制，結(jié)果如下：( 1 ) 蛋白酶體活性抑制對(duì)t a u 蛋白總量和磷酸化程度的影響蛋白酶體活性抑制可誘導(dǎo)t a n 蛋白總量增加，t a u - T h r 2 3 1 ，S e r 3 9 6 ，T h r 2 0 5 和S e r l 9 5 ／1 9 8 ／19 9 ／2 0 2 位點(diǎn)磷酸化程度增加，提示t a u 蛋白和磷酸化t a u 蛋白可能都是蛋白酶體的降解底物。但蛋白酶體活性抑制后t a

10、u - S e r 2 1 4 位點(diǎn)磷酸化程度下降。( 2 ) 蛋白酶體與G S K - 3 1 B 之間的關(guān)系G S K ．3 D 是調(diào)節(jié)t a u 蛋白磷酸化的主要激酶之一，而蛋白酶體活性抑制后引起的t a u 蛋白過度磷酸化修飾的位點(diǎn)( 1 1 Ⅱ2 3 1 ，S e r 3 9 6 ，m 2 0 5 和S e r l 9 5 ／1 9 8 ／1 9 9 ／2 0 2 )均是G S K ．3 B 的調(diào)節(jié)位點(diǎn)，因此為了闡述蛋白酶體活