1、目的： 1．明確mic2/CD99在人HL細胞株和cHL組織中H/RS細胞的表達情況。 2．構建mic2/CD99基因的真核表達載體。 3．構建L428-CD99細胞模型并進行初步鑒定。 方法： 1．設計寡核苷酸探針，采用分子原位雜交和免疫組化技術檢測mic2/CD99在HL細胞株L428中及人15例cHL組織中H/RS細胞的表達。 2．設計mic2/CD99基因特異性PCR引物，采用RT

2、-PCR法從T淋巴瘤細胞株Jurkat細胞總RNA中獲取mic2/CD99基因全長cDNA，克隆入T載體，篩選陽性克隆、酶切鑒定并經(jīng)序列測定；設計含酶切位點的PCR引物，PCR獲取mic2/CD99基因表達編碼區(qū)，用限制性內切酶Kpn Ⅰ和Apa Ⅰ雙酶切取所需目的片段，利用分子克隆技術與pcDNA3.1(+)質粒重組，對產生的重組子進行PCR、雙酶切鑒定，并經(jīng)過測序證實。 3．經(jīng)過穩(wěn)定轉染和G418克隆篩選，上調L428細胞m

3、ic2/CD99基因，用軟瓊脂克隆形成法和96孔板有限稀釋法篩選L428-CD99單克隆，并擴增培養(yǎng)該克隆，建立細胞模型，命名為L428-CD99。 4．應用分子生物學技術檢測L428-CD99細胞基因組與pcDNA3.1(+)-CD99載體整合情況；光鏡下觀察L428-CD99細胞形態(tài)特征；光鏡下測試網(wǎng)格計數(shù)法動態(tài)監(jiān)測由L428的H/RS細胞(直徑=25um)轉化為L428-CD99細胞的轉化率； 免疫組化檢測CD99

4、、CD30在L428-CD99和L428細胞中的表達；流式細胞術檢測L428-CD99、L428細胞及人B淋巴瘤細胞株BJAB中CD30和CD15的表達。 結果： 1．人HL細胞株和cHL組織中H/RS細胞mic2、CD99基因檢測人HL細胞株和cHL組織H/RS細胞的mic2/CD99基因mRNA及蛋白(14/15，93.3％)呈陰性表達。 2．mic2/CD99真核表達載體構建RT-PCR法獲得mic2/CD

5、99基因全長eDNA序列，DNA測序的結果與GenBank提供的已知序列(NM-002414)完全一致；重組質粒pcDNA3.1(+)-CD99中的插入片段經(jīng)DNA測序后與GenBank中mic2/CD99基因相應序列比較100％同源。成功構建了pcDNA3.1(+)-CD99真核表達載體。 3．L428-CD99細胞模型的建立及初步鑒定利用脂質體轉染L428細胞，經(jīng)G418克隆篩選10d后停藥，復蘇培養(yǎng)10d后形成L428-C

6、D99單克隆，擴增培養(yǎng)該克隆6-7d，出現(xiàn)明顯形態(tài)改變，細胞體積變小，細胞核變小，本研究將轉型的細胞命名為L428-CD99細胞。定期收獲實驗組(L428-CD99)和對照組(L428)細胞，檢測轉染質粒與細胞基因組整合情況，電泳可見基因片段558bp，證實載體已轉入細胞，并整合到基因組。細胞計數(shù)結果顯示，接種96孔板48h后，對照組(L428)中的大細胞或H/RS樣細胞(直徑=2μm)比例為(10.17±0.0194)％，實驗組(L4

7、28-CD99)細胞中H/RS樣細胞的比例為(3.33±0.0103)％，接種96孔板96h后，L428細胞中的大細胞比例為(11.50±0.0339)％，L428-CD99細胞中H/RS樣細胞比例為(3.67±0.0126)％。繪制兩組細胞中H/RS細胞生長曲線，經(jīng)統(tǒng)計分析，L428-CD99細胞中H/RS樣細胞與對照組細胞L428相比有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，大H/RS樣細胞在L428細胞明顯高于L428-CD99細胞。細胞片免

8、疫組化實驗顯示，CD30蛋白在L428的H/RS細胞胞膜中呈陽性表達，而在L428-CD99細胞的H/RS細胞中呈陰性表達；流式細胞儀檢測L428-CD99、L428、BJAB細胞株CD30和CD15的表達，陽性表達率分別為3.17％、55.24％、4.64％；檢測CD15的表達，陽性表達率分別為4.15％、12.01％、3.44％。 結論： 1．人HL細胞株L428和eHL組織H/RS細胞中mic2/CD99在mRNA

9、水平和蛋白水平均為低表達，CD99低表達或表達缺失或可作為H/RS細胞表型的一個特點。 2．上調人HL細胞株L428細胞mic2/CD99表達，可以誘導H/RS細胞形態(tài)、免疫表型和生物學特性發(fā)生改變或消失。創(chuàng)新之處1．證實人HL細胞株L428和cHL組織中H/RS細胞mic2/CD99的mRNA和蛋白呈低表達，提出CD99低表達或表達缺失或可作為H/RS細胞表型的一個特點。 3．構建了L428-CD99細胞模型，發(fā)現(xiàn)mi