1、第一章不同濃度嗜酸乳酸桿菌對實驗性結腸炎的療效 目的：通過比較不同濃度嗜酸乳酸桿菌治療實驗性結腸炎的療效，尋找治療實驗性結腸炎適宜的嗜酸乳酸桿菌濃度。 方法：實驗用Balb/c小鼠72只，雌性，6-8周齡，體重20.0±2.0克，購于湖南農業(yè)大學東創(chuàng)實驗動物科技服務部，飼養(yǎng)于清潔級動物房，隨機分成9組，每組8只，飼養(yǎng)于標準條件下(濕度50％±10％；12h白晝/12h黑夜輪換)，喂食普通小鼠飼料。分組情況如下：(1)模型

2、組：飲用5％DSS造模；(2)生理鹽水組：5％DSS造模+NS(1ml/10g)灌胃(3)(C4組)：50/oDSS造模+1×104CFU/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(4)(C5組)：5％DSS造模+1×105CFU/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(5)(C6組)：5％DSS造模+1×106CFU/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(6)(C7組)：5％DSS造模+1＋107CFU/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(7)(C8組)：5％DSS造模+1×108CF

3、U/10g嗜酸乳酸桿菌灌胃；(8)醋酸潑尼松組：5％DSS造模+醋酸潑尼松(45ug/lOg)灌胃；(9)正常組：正常飲食，無特殊處理。實驗期間每日觀察小鼠進食、飲水、活動等一般情況，稱量體重，觀察糞便性狀及糞便隱血、便血情況，計算DAI積分，評估結腸炎嚴重程度。實驗第7天，乙醚麻醉狀態(tài)下處死小鼠，解剖腹腔，觀察結腸的大體改變、測量長度。于結腸距回盲部1cm處和肛門1cm處各剪取0.5cm長的結腸用于細菌分析，另取肛門附近結腸組織長度約

4、0.5cm于中性福爾馬林中固定，石蠟包埋切片H＆E染色，其余結腸液氮保存以備它用。 結果：中等濃度的嗜酸乳酸桿菌干預組C6(106CFU/ml濃度級)組小鼠實驗性結腸炎癥狀緩解最明顯，DAI評分及組織損傷評分最低。 結論：嗜酸乳酸桿菌治療實驗性結腸炎有一定的量效關系，然而并非完全正相關，中等濃度(106CFU/ml濃度級)組療效最佳。 第二章嗜酸乳酸桿菌對實驗性結腸炎小鼠模型結腸近、遠端細菌的影響 目的：

5、研究實驗性結腸炎模型鼠經不同濃度的嗜酸乳酸桿菌治療后近、遠端腸道菌群的改變 方法：實驗動物、分組、模型建立及給藥方案與第一章相同，于實驗第7天，乙醚麻醉狀態(tài)下處死小鼠，解剖腹腔，在結腸距回盲部1cm處和肛門1cm處各剪取0.5cm長的結腸，稱量后滅菌勻漿器勻漿，用滅菌NS按梯度稀釋法稀釋，選擇7種選擇性培養(yǎng)基分析腸道菌群具有代表性的厭氧菌3種(乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌)，需氧菌3種(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、腸球菌)及總需氧菌

6、。根據(jù)各菌菌落形態(tài)特征、革蘭染色及光鏡下特征進行初步鑒定。對厭氧菌(雙歧桿菌及乳酸桿菌)和腸球菌培養(yǎng)分離取得純菌后，采用API試驗條接種后讀取結果，用數(shù)字圖譜判定鑒定結果 結果：各實驗組近端結腸由7種選擇性與非選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌數(shù)無明顯差別，遠端結腸醋酸潑尼松組小鼠各種細菌特征與DSS造模組類似，各嗜酸乳酸桿菌干預組以C6(106CFU/ml濃度級)組小鼠的益生菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌)數(shù)量最多，與其余各組比較有顯著差異(p<

7、0.05)，致病菌(金黃色葡萄球菌)最低與其余各組比較有顯著差異(p<0.05)，其它選擇性培養(yǎng)基的細菌數(shù)無明顯差別。 結論： 1.嗜酸乳酸桿菌不定植于近端結腸，對近端結腸菌群無影響。 2.嗜酸乳酸桿菌能定植于遠端結腸，對遠端結腸菌群有影響，增加益生菌(乳酸桿菌、雙歧桿菌)的生長，抑制致病菌(金黃色葡萄球菌)生長，以106CFU/ml濃度級組作用最明顯。 第三章嗜酸乳酸桿菌對實驗性結腸炎小鼠模型Th17/

8、IL23免疫軸的影響 目的：探討不同濃度的嗜酸乳酸桿菌對實驗性結腸炎模型鼠起治療作用的免疫學機制。研究嗜酸性乳酸桿菌對與IBD發(fā)病密切相關的Th17/IL23免疫軸主要相關細胞因子和信號因子：IL17、IL23、TGFβ，TNFa、STAT3和P-STAT3的影響，為進一步探索嗜酸乳酸桿菌治療實驗性結腸炎機制以及用量提供幫助。 方法：實驗動物、分組、模型建立及給藥方案與第一章相同，在實驗結束時處死動物留取各組結腸標本，行

9、western blotting和RT-PCR技術檢測小鼠結腸黏膜內細胞因子IL17、IL23、TGFB、TNFa及信號因子STAT3和P-STAT3的表達量，以及免疫組化檢測信號因子STAT3，P-STAT3在結腸組織的表達部位及表達量。 結果：各項指標的mRNA水平和蛋白質水平顯示：均為模型組最高，NS組次之，醋酸潑尼松組較模型組有明顯降低。 對于不同濃度的嗜酸乳酸桿菌組，結果顯示：Th17細胞分化相關的細胞因子(I

10、L23、TGFB)以105CFU/mL組表達量最低，且效果優(yōu)于醋酸潑尼松組(p<0.05)。Th17細胞分化相關的信號因子(STAT3，p-STAT3)，以105CFU/mL、106CFU/mL組表達量最低，效果優(yōu)于醋酸潑尼松組(p<0.05)，其中STAT3的檢測中RT-PCR和免疫組化方法檢測結果顯示106CFU/mL組檢測量最低，105CFU/mL、104CFU/mL、107CFU/mL組次之，優(yōu)于醋酸潑尼松組(p<0.05)；W

11、B方法顯示105CFU/mL組檢測量最低，106CFU/mL、104CFU/mL、107CFU/mL組次之，優(yōu)于醋酸潑尼松組(p<0.05)。關于p-STAT3表達的蛋白質水平比較結果顯示：嗜酸乳酸桿菌干預組中免疫組化方法檢測結果顯示106CFU/mL組檢測量最低，105CFU/mL、107CFU/mL組次之，且106CFU/mL、105CFU/mL均較醋酸潑尼松組低(p<0.05)；WB方法顯示105CFU/mL組檢測量最低，106C

12、FU/mL、104CFU/mL、107CFU/mL組次之，且均較醋酸潑尼松組低(p<0.05)。Th17細胞產生的與機體免疫損傷和實驗性結腸炎形成相關的促炎因子(IL17、TNFa)以105CFU/mL組IL17表達量最低，106CFU/mL組TNFa表達量最低。 結論： 1.嗜酸乳酸桿菌干預組的Th17分化相關細胞因子(IL23、TGFB)，Th17分化相關信號因子(STAT3、p-STAT3)及實驗性結腸炎形成相關的