1、油菜作為重要的油料作物和經(jīng)濟作物，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。然而油菜生產(chǎn)過程中，菌核病的發(fā)生嚴重制約著菜籽的產(chǎn)量，嚴重時大田發(fā)病率達80％以上。由于菌核病兼具土傳和氣傳兩種傳播方式，一直以來難以防治。目前，生物防治作為替代傳統(tǒng)化學(xué)防治受到廣泛關(guān)注。在本實驗室利用生物有機肥防控多種作物土傳病害取得重要成果的基礎(chǔ)上，本文通過篩選獲得對油菜菌核病病原菌具有高效抑制作用的兩株拮抗菌，對其葉面防病能力和抑菌機理進行了研究，并探討了其中一株防控效果

2、較好的拮抗菌制成的生物有機肥對油菜生長的促進作用。全文取得如下成果:
　　1、從紫金山森林土壤中分離得到多株對油菜菌核病病原菌核盤菌有抑制能力的菌株。平板對峙實驗發(fā)現(xiàn)，菌株NJZJSB3和菌株NJZJSA2對核盤菌的抑制作用最強，其發(fā)酵濾液抑菌圈直徑分別達到27 mm和44 mm。并且兩株菌都具有廣譜的抑菌效果，對F.oxysporum f.sp.niveum,F.oxysporum f.sp.cucumuerimu,F.oxys

3、porum f.sp.melonis,Verticillium dahliae Kleb,Rhizoctonia solani,F.oxysporum f.sp.cubense,F.oxysporum Schlecht等多種植物土傳病原菌具有強烈的抑制作用。同時，油菜離體葉片侵染實驗表明兩株菌均能很好地抑制核盤菌的侵染。通過傳統(tǒng)的形態(tài)、生理生化特性分析結(jié)合分子生物學(xué)的方法對菌株NJZJSB3和NJZJSA2進行了鑒定，確定其分別為解淀粉

4、芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和小白鏈霉菌(Streptomyces albulus)。
　　2、菌株NJZJSB3在初始pH為7的Landy培養(yǎng)基中，35℃/170 r·min-1條件下培養(yǎng)60h，其發(fā)酵濾液抑菌直徑達到36.7 mm;菌株NJZJSA2在初始pH為6的CGA培養(yǎng)基，30℃/170 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d，其發(fā)酵濾液抑菌直徑達到46.8 mm。菌株NJZJSB3和菌林NJ

5、ZJSA2發(fā)酵產(chǎn)物分別在pH2～7和pH6～8作用下抑菌活性相對穩(wěn)定;經(jīng)50～70℃和蛋白酶（蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白）處理后發(fā)酵產(chǎn)物活性相對穩(wěn)定，抑菌圈直徑下降不明顯。盆栽葉面防病試驗結(jié)果表明:相對于對照處理的發(fā)病率為100％時，噴施菌株NJZJSB3和NJZJSA2菌懸液后菌核病發(fā)病率則分別為13.3％和36.7％;噴施菌株NJZJSB3和NJZJA2發(fā)酵濾液后菌核病發(fā)病率則分別為16.0％和0％;且各處理發(fā)病葉片病斑直徑顯著低于

6、對照處理葉片病斑直徑。
　　3、以菌株NJZJSB3的總DNA為模板進行PCR擴增得到8個脂肽類抗生素合成相關(guān)的基因。通過酸沉淀-甲醇抽提法對菌株NJZJSB3發(fā)酵液中脂肽類抑菌物質(zhì)進行提取，粗提物對核盤菌菌絲生長的抑制率為71.1％。通過HPLC-ESI-MS分析從粗提物中檢測出質(zhì)荷比分子量為1，030.6，1，044.7，1，058.8，1，072.8，1，086.8 Da的抑菌物質(zhì)。經(jīng)高效液相色譜(HPLC)分析發(fā)現(xiàn)粗提物出

7、峰的保留時間與iturin A標準物質(zhì)出峰保留時間一致，確定菌株NJZJSB3分泌抑菌物質(zhì)為iturin A類脂肽類物質(zhì)。此外，菌株NJZJSB3還能產(chǎn)生揮發(fā)性有機物，其對核盤菌菌絲生長的抑制率為40.3％。通過GC-MS分析檢測出其中含有苯并噻唑、十七烷和植酮等物質(zhì)。其中，苯并噻唑的純品對核盤菌菌絲生長具有抑制能力。菌株NJZJSB3還能分泌嗜鐵素、葡聚糖酶和蛋白酶等與抑菌相關(guān)的物質(zhì)。
　　4、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加滅活核盤菌菌絲作

8、為碳源可以誘導(dǎo)菌株NJZJSA2分泌多種胞外酶，發(fā)酵濾液中幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和蛋白酶的活性分別比對照提高了4.4、9.5和2.7倍。通過硫酸銨沉淀法提取發(fā)酵濾液中的粗蛋白，對核盤菌菌絲的生長具有抑制作用。掃描電鏡(SEM)分析結(jié)果表明，經(jīng)粗蛋白溶液處理的核盤菌菌絲和菌核表皮細胞壁坍塌、破裂。在油菜離體葉片防病實驗中，經(jīng)粗蛋白酶溶液噴施處理的油菜葉片菌核病病斑平均直徑比對照小12.2 mm。菌林NJZJSA2利用小麥粒培養(yǎng)基產(chǎn)

9、生的揮發(fā)性有機物，能顯著抑制核盤菌菌絲生長及菌核萌發(fā)。通過GC-MS分析從揮發(fā)性有機物中檢測出12種物質(zhì)，分別屬于芳烴、烷烴、醚類、脂類和烯烴。其中，五種物質(zhì)對核盤菌均有抑制作用，其抑菌效果排序為:4-甲氧基苯乙烯＞2-戊基呋喃＞苯甲醚＞苯乙烯＞正十四烷。掃描電鏡(SEM)觀察4-甲氧基苯乙烯處理后的核盤菌菌絲，發(fā)現(xiàn)菌絲末端腫脹和縮短，細胞壁凹陷和坍塌，但未破損。胎盤藍染色結(jié)果表明，4-甲氧基苯乙烯破壞了核盤菌菌絲的細胞膜的活性，使其失

10、去選擇通透性。推測菌株NJZJSA2產(chǎn)揮發(fā)性氣體通過抑制核盤菌菌絲細胞膜活性，達到抑制菌絲生長的目的。
　　5、經(jīng)菌株NJZJSA2菌懸液灌根處理，油菜幼苗地上部和地下部生物量分別提高了45.0％和30.4％，且顯著提高了油菜總根長、根表面積、根體積。對菌株NJZJSA2促生機理分析結(jié)果顯示，菌株NJZJSA2具有解磷和分泌鐵載體的能力，并在其發(fā)酵液中檢測到促生類物質(zhì)IAA。菌株NJZJSA2能利用根系分泌物定殖到油菜根系上生長，

11、油菜幼苗根系分泌物中的草酸、蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸對菌株NJZJSA2菌絲的生長及孢子萌發(fā)具有促進作用。第一次盆栽促生實驗結(jié)果顯示，施用含有NJZJSA2的生物有機肥(BOF)能顯著增加油菜苗的生物量，地上部和地上部鮮重分別比施用化肥(CF)提高31.8％和25.5％。施用普通有機肥(OF)的油菜地上部和地下部鮮重與CF處理比較沒有顯著差異。與CF相比，施用BOF后土壤中的脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶的酶活分別提高了18.4％，

12、13.5％，70.6％和45.4％;而施用OF的上述土壤酶活分別提高了6.69％，6.97％，69.8％和33.2％。第二次盆栽促生實驗結(jié)果顯示，施用菌株NJZJSA2菌懸液(A2)比空白對照(CK)油菜地上部生物量提高11.7％，施用BOF油菜地上部生物量比OF提高了25.7％。兩次盆栽結(jié)果表明菌株NJZJSA2制備的生物有機肥比單純施用NJZJSA2菌體具有更好的促生能力。
　　6、田間試驗表明，CF，OF和BOF處理的田塊油

13、菜地上部生物量均顯著高于不施肥處理(CK)。BOF處理油菜地上部鮮重、株高和莖粗顯著高于OF與CF處理，OF與CF處理的油菜地上部生物量無顯著差異。對不同時期油菜植株根際土壤和土體土壤微生物計數(shù)結(jié)果顯示，油菜根際土微生物數(shù)量顯著高于土體土。與CF相比，施用BOF顯著促進油菜根際土壤細菌和放線菌的數(shù)量增加，減少真菌的數(shù)量。施用OF在提高油菜根際土壤細菌、放線菌的數(shù)量，同時也促進了真菌數(shù)量的增加。油菜籽產(chǎn)量及油菜菌核病統(tǒng)計結(jié)果顯示BOF、O

14、F、CF和CK處理菌核病發(fā)病率分別是42.7％，53.0％，46.3％和58.0％，沒有顯著差異。各田塊產(chǎn)量分別是241.9、221.1、215.2和96.9 kg/畝。第二次田間實驗結(jié)果顯示，施用BOF聯(lián)合葉面噴施菌株NJZJSA2發(fā)酵液處理(BOF+噴施A2)田塊的菌核病發(fā)病率為40.0％，比單施BOF低15.3％。CF加葉面噴施菌株NJZJSA2發(fā)酵液處理（CF+噴施A2）田塊的菌核病發(fā)病率為52.0％，比單施CF處理低16.0％

15、。BOF+噴施A2、BOF、CF+噴施A2和CF處理的油菜籽產(chǎn)量分別為284.8、181.9、240.8和155.8 kg/畝。
　　綜上所述:拮抗菌NJZJSB3和NJZJSA2能分泌多種抑菌物質(zhì)，在盆栽實驗中能較好的抑制核盤菌侵染油菜葉片。菌株NJZJSA2能分泌多種促生相關(guān)的物質(zhì)，能顯著促進油菜的生長。其與有機肥二次發(fā)酵制成的生物有機肥不僅能促進油菜的生長和提高油菜籽產(chǎn)量，對油菜菌核病也有一定的防效。結(jié)合施用生物有機肥與葉面