1、結(jié)腸癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，結(jié)腸癌的耐藥現(xiàn)象是影響其化療療效和預(yù)后的主要原因之一。為克服腫瘤耐藥，多年來人們對腫瘤的耐藥機制進行了大量的研究。已證實多種腫瘤組織均有NF-γB的高表達，而多種抗癌藥物均可激活NF-γB，NF-γB高表達的腫瘤細胞表現(xiàn)為對化療、射線等介導(dǎo)凋亡的抵抗作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞存在著群集耐藥現(xiàn)象，結(jié)腸癌細胞三維立體培養(yǎng)時NF-γB活性明顯高于普通單層培養(yǎng)，NF-γB活性與藥物敏感性呈顯著負相關(guān)，

2、抑制NF-γB活性，可顯著增加藥物的敏感性，說明NF-γB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是介導(dǎo)腫瘤群集耐藥的重要途徑。近年有作者甚至認為，NF-γB活化可能代表一個比多藥耐藥基因更為重要的耐藥機制。合理設(shè)計與NF-γB活化抑制劑聯(lián)合的化療方案，將有助于降低腫瘤細胞的抗凋亡閾值，成為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥和化療增敏新的策略和有效方法。 目前，針對抑制NF-γB活性的策略，直接將突變型IγBα基因轉(zhuǎn)移到腫瘤患者體內(nèi)還存在著許多技術(shù)難題尚未克服；反義寡核苷酸治療

3、有可能導(dǎo)致機體一些重要基因功能的喪失；正常情況下，由于蛋白酶體和鈣調(diào)節(jié)蛋白酶等是細胞周期和細胞功能的重要調(diào)節(jié)劑，所以其抑制劑的臨床應(yīng)用還存在很大問題；而圈套寡核苷酸無論從技術(shù)和經(jīng)濟上目前也很難在臨床廣泛應(yīng)用。因此，如何選擇高效、安全的NF-γB抑制劑，仍是目前臨床醫(yī)學(xué)中有待解決的問題。進一步發(fā)掘靶點特異、高效、低毒的藥物，尋找天然NF-γB活性抑制劑，將為拮抗NF-γB功能開辟更加廣闊的前景。 中醫(yī)中藥是我國獨有的優(yōu)勢，從中藥中

4、提取具有化療增敏和逆轉(zhuǎn)耐藥作用的中藥單體，可大大提高腫瘤的治療效果，具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟和社會效益。目前已有許多中藥或中藥方劑用于腫瘤的治療，也發(fā)現(xiàn)很多中藥具有逆轉(zhuǎn)耐藥和化療增敏的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿、雷公藤、銀黃、黃芪等中藥具有抑制NF-γB活化的作用，青蒿素、大黃素、黃芩甙等中藥有效成分也有拮抗NF-γB活化的作用。因此，如果能從中藥中分離制備與NF-γB及其亞單位作用的有效單體，將為尋找有效的NF-γB抑制劑提供一條新

5、的途徑。 由于中藥組成成分復(fù)雜，如能采用有效手段，確定與NF-γB作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，分離制備出抑制NF-γB活化的有效單體，將對NF-γB抑制劑的開發(fā)具有重要意義。光學(xué)生物傳感器技術(shù)是利用光學(xué)原理，在生物傳感器的樣品池表面包被固定受體，當(dāng)受體與其配結(jié)合體時，以共振角度進入光線衰竭區(qū)的激光就會發(fā)生共振角度的改變，這一變化通過計算機處理后就可以檢測到傳感器表面受體與其配體分子之間的相互作用及親和力。通過特異性的洗脫及回收，即可得到純度

6、極高的配體分子。 本實驗在既往研究工作的基礎(chǔ)上，以青蒿為研究對象，利用生物傳感器技術(shù)，制備出青蒿中與NF-γB特異性結(jié)合的活性物質(zhì)，繼而對該物質(zhì)的理化性質(zhì)及抑制NF-γB活化的能力進行測定；在體外采用腫瘤細胞三維立體培養(yǎng)模型，觀察其抑制NF-γB活性及其對凋亡相關(guān)蛋白、細胞凋亡和對藥物敏感性的影響；同時進一步觀察其對動物腫瘤模型化療增敏和逆轉(zhuǎn)耐藥的效果，以期為腫瘤的化療增敏和逆轉(zhuǎn)耐藥提供新的策略，為其他NF-γB活化相關(guān)疾病如感

7、染、炎癥、移植等的治療提供新的思路。 方法： 1.應(yīng)用生物傳感器特異性洗脫回收、有機溶劑萃取、硅膠柱色譜、薄層層析等方法對青蒿中NF-γB的特異性抑制劑進行篩選分離提??； 2.檢測所得物質(zhì)的理化性質(zhì)，進行紅外光譜、高效液相、核磁共振波譜、質(zhì)譜等檢測，對所得物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)鑒定； 3.體外采用結(jié)腸癌HT-29細胞三維立體培養(yǎng)模型，觀察所得物質(zhì)對結(jié)腸癌細胞球NF-γB活性(EMSA方法)及化療藥物敏感性的影響；

8、 4.應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測所得物質(zhì)對結(jié)腸癌細胞球細胞周期、細胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、FAS、FAS-L的影響； 5.體內(nèi)采用結(jié)腸癌HT-29細胞裸鼠皮下移植瘤模型，測量裸鼠移植瘤的腫瘤體積及稱取腫瘤重量，計算瘤體積和瘤重抑制率，觀察所得物質(zhì)與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用后對腫瘤生長影響； 6.應(yīng)用EMSA、免疫組織化學(xué)的方法檢測不同處理組腫瘤組織中NF-γB活性及凋亡相關(guān)蛋白的變化情況。 結(jié)果： 1.成

9、功分離提取制備得到青蒿中能與NF-γB特異性結(jié)合的有效活性物質(zhì)，并測定其理化性質(zhì)為淡黃色粉針狀，略溶于水，溶于乙醇，易溶于氯仿、乙酸乙酯，熔點在202-203℃。 2.紅外光譜檢測結(jié)果，提取得到的化合物IRvKBrmaxcm-1在：3334.7、1701.1、1566.1、1290.3附近有明顯振幅波峰。 核磁共振波譜結(jié)果： 1H-NMR(CDCl3)δppm:3.959(3H，s，OCH3)，6.207(1H，

10、s，OH)，6.276(1H，d，J=9.2，H-3)，6.852(1H，s，H-8)，6.923(1H，s，H-5)，7.608(1H，d，J=10，H-4)。 13C-NMR(CDCl3)δppm:161.383(C-2)，113.433(C-3)，143.236(C-4)，107.542(C-5)，149.733(C-6)，150.301(C-7)，103.213(C-8)，144.029(C-9)，111.509(C-1

11、0)，56.434(-OCH3)。 分析紅外光譜、核磁共振波譜及質(zhì)譜等檢測結(jié)果，初步得出所得物質(zhì)的結(jié)構(gòu)并將其暫時命名為AH-I。 3.AH-I應(yīng)用后，結(jié)腸癌HT-29細胞球NF-κB的活性受到抑制，AH-I與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對細胞球NF-κB活性的抑制作用更強。 4.單獨AH-I應(yīng)用后，與對照組比較，結(jié)腸癌HT-29細胞球細胞周期的變化不明顯，大部分細胞位于G1期；而AH-I與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，結(jié)腸癌HT-29

12、細胞球細胞周期明顯受到影響，G1期細胞明顯減少，細胞向S期轉(zhuǎn)化，且AH-I應(yīng)用劑量越大效應(yīng)越明顯。 5.AH-I與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，結(jié)腸癌HT-29細胞球細胞凋亡率與單獨化療組比較明顯增加，且隨著AH-I應(yīng)用劑量的增加，細胞球細胞凋亡率增加越明顯，存在劑量依賴效應(yīng)。 6.AH-I與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，結(jié)腸癌HT-29細胞球抗凋亡蛋白Bcl-2的表達與單獨化療組比較有所減少，而促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表達較單獨化療

13、組明顯增多，且都具有劑量依賴效應(yīng)。 7.結(jié)腸癌HT-29細胞球應(yīng)用AH-I后，對化療藥物5-Fu的敏感性增強，且隨著AH-I應(yīng)用劑量的增加，結(jié)腸癌細胞球?qū)熕幬锏拿舾行栽黾釉矫黠@，具有劑量依賴效應(yīng)。 8.體內(nèi)裸鼠移植瘤模型，AH-I與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用后腫瘤的瘤體積與單獨化療組比較有所減小，腫瘤的瘤重與單獨化療組比較也有所減輕，瘤體積抑制率、瘤重抑制率與單獨5-Fu組比較均明顯增加，腫瘤生長受到抑制。 9.體內(nèi)裸

14、鼠移植瘤模型應(yīng)用AH-I后，腫瘤組織NF-κB活性受到抑制，且AH-I與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用組腫瘤組織的NF-κB活性的抑制較單獨化療組更明顯，且同樣具有劑量依賴效應(yīng)。 10.AH-I與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用后，裸鼠移植瘤腫瘤組織中抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表達增加，且與AH-I的應(yīng)用劑量有關(guān)，AH-I應(yīng)用劑量越大，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少及促凋亡蛋白FAS、FAS-L的表達增加更明顯，都具有劑量依賴

15、效應(yīng)。 結(jié)論： 1.成功分離得到青蒿中NF-κB的特異性抑制劑，分析其結(jié)構(gòu)后暫時命名為AH-I。 2.AH-I對結(jié)腸癌HT-29細胞球的NF-κB活性有抑制，可增加結(jié)腸癌細胞球?qū)熕幬?-FU的敏感性。 3.AH-I與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，對結(jié)腸癌細胞球細胞周期、凋亡相關(guān)蛋白的表達產(chǎn)生影響，促進細胞凋亡的發(fā)生。 4.AH-I與5-FU聯(lián)合應(yīng)用后，在體結(jié)腸癌裸鼠移植瘤的腫瘤生長減慢，增強5-FU化療