1、化療是癌癥臨床治療的重要手段，化療藥物通過直接殺死腫瘤細胞或者抑制腫瘤細胞的分裂增殖、促進細胞分化來達到治療效果?；煹娜毕菔菬o差別地對正常細胞的殺傷作用。此外，腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性也是目前癌癥治療的一個主要障礙，近90％的轉(zhuǎn)移性和復發(fā)癌癥病人治療失敗都是由于耐藥性引起的。因此尋找高效低毒的抗腫瘤藥物以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性(Drug Resistance)是治療癌癥的兩個重要課題。本研究從蘑菇中提取到一種天然藥物成分Clitoc

2、ine(克力托辛)，并發(fā)現(xiàn)該化合物能有效抑制多種腫瘤細胞的增殖。更為重要的是我們首次報道了Clitocine能有效誘導耐藥性腫瘤細胞的凋亡以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥性。本文從分子生物學水平揭示了Clitocine的抗腫瘤生物活性的分子機理，并首次確定了該化合物是NF-κB的抑制劑，這一發(fā)現(xiàn)暗示了Clitocine可能具備更加廣泛的生物活性。本文的主要研究結(jié)果如下：
　　 1、Clitocine能夠誘導腫瘤細胞凋亡采用MTT法檢測

3、Clitocine對腫瘤細胞的毒性，結(jié)果顯示該化合物對多種腫瘤細胞包括肝癌細胞HepG2、R-HepG2(耐藥性HepG2)和SMMC-7721、宮頸癌細胞HeLa、胃癌細胞SGC-7901、子宮癌細胞MES-SA和MES-SA/Dx5(耐藥性MES-SA)以及乳腺癌細胞MCF-7和Bcap37等都表現(xiàn)出較高的活性抑制作用，其中對肝癌的毒性最大。而且Clitocine對敏感性HepG2細胞和耐藥性R-HepG2細胞的毒性很相近。進一步實

4、驗結(jié)果顯示Clitocine能夠誘導耐藥性肝癌細胞凋亡，包括出現(xiàn)DNA片段化(DNA ladder)、磷脂酰絲氨酸(PS)外翻、Caspase激活、線粒體膜崩潰以及PARP的剪切等一系列凋亡的典型特征。此外，Clitocine誘導的肝癌細胞凋亡涉及細胞外與細胞內(nèi)兩條信號通路。
　　 2、Clitocine誘導的細胞凋亡通過Bcl-2家族成員受到調(diào)控蛋白免疫印跡(Western Blot)結(jié)果顯示，Clitocine能夠使Bcl-

5、2家族成員抑凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)而促凋亡蛋白Bad上調(diào)。利用RNA干擾技術(shù)(RNAi)表明Bad的上調(diào)是Clitocine誘導耐藥性肝癌細胞凋亡的重要原因。
　　 3、Clitocine能夠下調(diào)P-糖蛋白的表達以逆轉(zhuǎn)耐藥性腫瘤細胞的耐藥性本文選用的兩株耐藥性細胞株R-HepG2和MES-SA/Dx5都是細胞膜泵P-糖蛋白(P-glycoprotein)過表達的，該蛋白的過表達是很多腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性的重要原因；我們的數(shù)據(jù)顯示C

6、litocine能夠顯著降低P-糖蛋白的表達水平。將Clitocine與阿霉素(Doxorubicin)配伍使用可有效增強耐藥性細胞對阿霉素的敏感性，大幅提高低濃度下阿霉素對耐藥性腫瘤細胞的殺傷作用。流式細胞術(shù)的數(shù)據(jù)顯示，Clitocine能夠增加阿霉素在細胞內(nèi)的積累。因此，我們推測Clitocine能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性與P-糖蛋白的表達被抑制密切相關(guān)。
　　 4、Clitocine通過下調(diào)NF-κB抑制P-糖蛋白的表達熒光

7、定量PCR的數(shù)據(jù)顯示，Clitocine下調(diào)了P-糖蛋白編碼基因MDR1的mRNA水平。我們推測Clitocine是在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MDR1基因的表達。因此，我們克隆了P-糖蛋白編碼基因MDR1的啟動子序列，并構(gòu)建螢光素酶基因報告系統(tǒng)。利用將啟動子分段分析的方法，確認Clitocine調(diào)控MDR1基因表達的特定啟動子區(qū)域。結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子預測軟件分析，得到NF-κB可能是Clitocine的作用靶點。染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)技術(shù)確認了NF

8、-κB能夠直接結(jié)合到我們確認的啟動子調(diào)控區(qū)域，結(jié)合位點的點突變以及NF-κB的過表達能夠逆轉(zhuǎn)Clitocine的調(diào)控作用。
　　 5、Clitocine能夠抑制NF-κB的激活Clitocine能夠抑制阿霉素誘導的NF-κB表達的增加，并降低NF-κB重要下游基因凋亡抑制蛋白家族成員XIAP的表達。利用電泳遷移率實驗(EMSA)，我們發(fā)現(xiàn)Clitocine能夠有效抑制NF-κB的激活以及活化NF-κB向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運。
　

9、　 6、Clitocine能夠在動物模型中抑制耐藥性腫瘤細胞的生長將耐藥性腫瘤細胞R-HepG2接種到裸鼠皮下形成腫瘤，Clitocine能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長。此外利用剝離的腫瘤組織進行免疫組織化學實驗，結(jié)果表明Clitocine能夠在體內(nèi)抑制P-糖蛋白的以及NF-κB的表達。
　　 概括起來，Clitocine能夠有效誘導耐藥性腫瘤細胞的凋亡，并通過抑制NF-κB的來下調(diào)P-糖蛋白的表達，進而逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的耐藥性。我們