1、目的：建立原代培養(yǎng)星形膠質細胞液壓沖擊損傷模型，利用雙向電泳結合質譜技術觀察腦皮質星形膠質細胞液壓沖擊損傷后蛋白質組的表達變化，探尋腦損傷的特異性生物標志蛋白。 方法：取出生后24h內SD大鼠(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)大腦皮質組織，于含有10％胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基中進行星形膠質細胞體外分離培養(yǎng)和純化，并以膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞化學染色進行純度鑒定。隨機將細胞分為對照組和損傷后4h、8h、12h、

2、24h、48h組，復制Scott's細胞液壓沖擊損傷模型(0.2MPa)。用臺盼藍染色觀察星形膠質細胞損傷前后形態(tài)學變化，測培養(yǎng)液中LDH活力反映細胞的損傷程度，PI/Hoechst33342染色進行凋亡分析。提取細胞總蛋白，經雙向電泳和MALDL-TOF質譜分析鑒定差異蛋白質。 結果： 1.星形膠質細胞原代培養(yǎng)和純化：經2-3次搖床傳代純化培養(yǎng)后的星形膠質細胞形態(tài)均一，胞體較大而扁、胞質較豐富、形狀不規(guī)則；胞突豐富、分

3、支多呈放射狀，一級胞突較粗，常有二級分支；胞核圓形或橢圓形，常偏于胞體一側。培養(yǎng)至24-26d，細胞生長狀態(tài)良好，鋪滿皿底，形成大致均一的扁平細胞層。 2.星形膠質細胞的純度鑒定：采用GFAP免疫細胞化學染色(SP法)，計數(shù)結果顯示培養(yǎng)的星形膠質細胞純度可達94.9％±1.9％。 3.液壓沖擊損傷后星形膠質細胞形態(tài)學的改變：光鏡下觀察，細胞隨時間發(fā)生間隙增大、腫脹、變圓、恢復，部分細胞發(fā)生皺縮、胞膜破裂、脫壁等顯著的形態(tài)

4、學改變；PI/Hoechst33342(1:1)熒光雙染可見凋亡細胞。 4液壓沖擊損傷后細胞培養(yǎng)液中LDH的變化：與正常對照組細胞培養(yǎng)液相比，損傷后各組細胞培養(yǎng)液中LDH活力均降低，4h組降至最低，與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。然后其它組逐漸上升，48h組與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 5 液壓沖擊損傷后星形膠質細胞雙向電泳圖譜分析：雙向電泳圖譜經PDquest軟件分析檢測到的各組總蛋白點數(shù)：對照

5、組1369±56，4h組1325±94，8h組1136±81，12h組1197±112，24h組1257±63，48h組1176±73。蛋白點多分布于pI5.2-6.6、MW30kDa-70kDa的范圍；以對照組為參考膠，平均圖譜匹配率達82％以上。損傷后共有265個蛋白質點的相對強度與正常對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，其中38個蛋白質點在損傷后表達升高，111個蛋白質點在損傷后表達下降，45個蛋白質點為損傷后新表達，有71個

6、蛋白質點在損傷后各組均未表達。 6 差異蛋白質的質譜鑒定：對9個差異蛋白點行MALDI-TOF質譜鑒定，其中8個點得分大于61分(P＜0.05)，分別為60S酸性核糖體蛋白P2(60S acidic ribosomal protein P2)、細胞視黃醇結合蛋白(cellular retinol binding protein，Crbp)、腦脂肪酸結合蛋白7(brain fatty acid binding protein 7，

7、FABP7)、S-100鈣結合蛋白A11(S100 calcium binding protein A11，S100A11)、假設蛋白LOC685814(hypothetical protein LOC685814)、真核生物翻譯起始因子1A(Eukaryotic translation initiation factor 1A，eIF-1A)、乳腺癌擴增序列2同源體(Breast carcinoma amplified sequenc

8、e 2 homolog,BCAS2)、鈣結合蛋白3(calponin 3)。其中對FABP7行Western-blot驗證，結果顯示：FABP7在星形膠質細胞中存在表達，而且該蛋白在星形膠質細胞液壓沖擊損傷后的變化趨勢與雙向電泳圖像經PDQuest軟件分析后得到的蛋白質變化趨勢相一致。 結論： 1.液壓沖擊損傷可引起星形膠質細胞形態(tài)學發(fā)生改變，且有一定的時間依從性。 2.液壓沖擊損傷能導致星形膠質細胞蛋白質組表達

9、發(fā)生變化，損傷后共有265個蛋白點的相對強度與正常對照組相比有顯著性差異，對其深入研究，有可能探尋到腦損傷的生物標志蛋白。 3.經MALDL-TOF質譜分析初步確定的8種蛋白大致分為代謝調節(jié)、信號轉導調節(jié)、翻譯起始相關類及其它等四類，這些蛋白表達的變化表明它們在參與星形膠質細胞損傷后早期反應、促進細胞功能恢復、抑制細胞繼發(fā)性損傷、參與細胞骨架組織重組及改善蛋白質合成等環(huán)節(jié)起重要作用，對其進行進一步研究，有望深入了解腦損傷的分子機