1、目的: 白血病細(xì)胞多藥耐藥(MDR)是化療失敗及緩解后復(fù)發(fā)的主要原因之一，克服多藥耐藥(MDR)是提高白血病療效的重要途徑。多藥耐藥性(MDR)是指腫瘤細(xì)胞接觸了一種藥物以后，不但對(duì)該藥產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)其它結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的藥物也產(chǎn)生耐藥性。它是由多種因素共同引起的一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，目前認(rèn)為由mdr1基因編碼的P-糖蛋白(P-gp)過(guò)表達(dá)造成抗癌藥物外排增加、藥效降低，是耐藥形成的主要原因。最新的研究結(jié)果顯示NF-kB通過(guò)引起m

2、dr基因表達(dá)增加調(diào)節(jié)P-gp介導(dǎo)細(xì)胞多藥耐藥?？鼓[瘤藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也激活NF-kB，NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與kB位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)NF-kB調(diào)控mdrl基因表達(dá)。蛋白酶體抑制劑硼替佐米通過(guò)阻止蛋白酶體降解IkB(NF-kB的負(fù)性調(diào)節(jié)器)，能顯著地抑制NF-kB出的活化，下調(diào)mdrl基因表達(dá)水平，刺激腫瘤細(xì)胞凋亡。從而增強(qiáng)治療效果和逆轉(zhuǎn)耐藥性。 最近的臨床前研究發(fā)現(xiàn)在一系列血液和實(shí)體惡性腫瘤體內(nèi)和體外模型中蛋白酶體抑制劑硼替

3、佐米可以減少細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)化療和放療的療效，并且逆轉(zhuǎn)化學(xué)藥物耐藥性。但目前關(guān)于硼替佐米的研究中所采用的腫瘤細(xì)胞系多為化療敏感株，而對(duì)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株研究很少。本實(shí)驗(yàn)采用表達(dá)mdrl-mRNA的白血病多藥耐藥細(xì)胞株，觀察硼替佐米作用前后白血病多藥耐藥細(xì)胞的mdr1-mRNA及其編碼的P-gp變化及細(xì)胞周期和凋亡的變化，進(jìn)一步探討mdr1-mRNA及其編碼的P-gp變化與細(xì)胞凋亡情況之間的關(guān)系。旨在進(jìn)一步明確硼替佐米逆轉(zhuǎn)白血

4、病細(xì)胞MDR的分子機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)材料: 1、K562/S和K562/DNR細(xì)胞株2、蛋白酶體抑制劑硼替佐米和柔紅霉素3、MTT法檢測(cè)細(xì)胞耐藥性相關(guān)試劑4、熒光定量PCR法檢測(cè)腫瘤多藥耐藥基因(mdr1)試劑盒5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp水平的相關(guān)試劑6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的相關(guān)試劑實(shí)驗(yàn)方法1、細(xì)胞培養(yǎng)K562/S和表達(dá)多藥耐藥基因mdr1的人K562/DNR細(xì)胞均培養(yǎng)于含100U/ml青霉素、100ug/ml鏈

5、霉素和12％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃，飽和濕度，5％CO2/95％空氣。 2、K562/DNR細(xì)胞耐藥性檢測(cè)接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/S，K562/DNR細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)12 h后，加入DNR繼續(xù)培養(yǎng)68h后，加入20ulMTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，2000r/min離心10 min，棄上清，每孔加150ul DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定540nm吸光度，完全培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每個(gè)濃度重復(fù)6個(gè)孔。 3、

6、細(xì)胞內(nèi)藥物濃度測(cè)定指數(shù)生長(zhǎng)期K562/S、K562/DNR細(xì)胞懸液用預(yù)冷的PBS洗滌3次后，用含12％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配制成1×106/mL細(xì)胞懸液，分別加或不加硼替佐米(終濃度10nmol/L)，再加DNR工作液，使DNR終濃度為5umol/L，37℃孵育90 min，離心棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入新鮮培養(yǎng)液，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNR熒光強(qiáng)度。 4、熒光定量PCR檢測(cè)mdr1-mRNA表達(dá)分別收集經(jīng)

7、0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L硼替佐米處理24h的細(xì)胞，采用Trizol提取總RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，由計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析出定量結(jié)果。 5、細(xì)胞中P-gp的檢測(cè)分別收集經(jīng)0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L硼替佐米處理24h的細(xì)胞，加入Anti-p-glycoprotein PE，流

8、式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)熒光強(qiáng)度(MFI)和陽(yáng)性率。 6、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡分別收集經(jīng)0nmol/L、5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L硼替佐米處理24h的細(xì)胞，Annexin/PI雙染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算凋亡百分率，記錄、存儲(chǔ)和分析結(jié)果。 7、細(xì)胞周期分析收集經(jīng)不同濃度硼替佐米(Onmol/L、5nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L)處理24h的細(xì)

9、胞，70％的冰乙醇固定，碘化丙錠(PI)染色，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞周期G1、S、G2+M時(shí)相分布。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNR蓄積水平顯示：硼替佐米能使K562/DNR細(xì)胞內(nèi)DNR含量增加。硼替佐米對(duì)K562/S細(xì)胞內(nèi)DNR含量無(wú)影響。 2、5-100nmol/L終濃度的硼替佐米在體外能明顯下調(diào)K562/DNR細(xì)胞的P-gp/mdr1-mRNA的表達(dá)，隨著藥物濃度的增加，P-gp/mdr1-mRNA的表達(dá)逐