1、番鴨（Cairna moschata），又稱疣鼻棲鴨，屬于棲鴨類。華盛頓公約(CITES)將其野生種群列入附錄三物種。野生番鴨棲息于熱帶地區(qū)，目前，在墨西哥、巴西和巴拉圭等國有其野生種群。因為番鴨具有較大的經(jīng)濟價值，其人工飼養(yǎng)數(shù)量逐年不斷增加。番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起，以1-3周齡雛番鴨為易感的一種急性傳染性、高死亡率的病毒病。耐過鴨往往生長發(fā)育遲緩，成為僵鴨，失去其

2、經(jīng)濟價值。該病呈世界范圍分布，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。MDPV只有一個血清型，從世界各地分離的病毒僅有微小差異。番鴨感染MDPV后，主要以體液免疫反應為主。B細胞抗原表位決定著機體產(chǎn)生抗體的特異性，是誘導體液免疫的基本單位。但至今國內外對MDPV蛋白的B細胞抗原表位知之甚少。病毒的非結構蛋白是在病毒復制過程中產(chǎn)生的，感染動物會產(chǎn)生抗非結構蛋白的抗體，而滅活疫苗或亞單位疫苗免疫的動物不會產(chǎn)生針對病毒非結構蛋白的抗體。因此可以利用非

3、結構蛋白抗體的存在與否來區(qū)分滅活疫苗免疫動物和自然感染動物。
　　為了對MDPV YL08株NS1蛋白（氨基酸序列全長627aa）進行抗原表位作圖，本研究設計了一套覆蓋整個NS1蛋白的短肽，這些短肽長為30個氨基酸左右，有10個氨基酸重疊。為了表達這些短肽，共設計合成了31對互補的寡核苷酸片段。每對寡核苷酸片段5'端磷酸化。上述寡核苷酸片段退火后，插入至原核表達載體pET-32a中，經(jīng)IPTG誘導獲得了相應重組蛋白的表達。利用切膠

4、純化的方法對表達蛋白進行了純化。純化蛋白經(jīng)抗His單克隆抗體鑒定。應用MDPV YL08株人工感染番鴨血清對表達的31個重組蛋白的抗原性進行了檢測，Western blot結果表明，表達的融合蛋白NS(481-510)、NS(501-530)、NS(521-550)、NS(541-570)、NS(561-590)、NS(581-610)和NS(601-627)能被MDPV感染血清所識別，而其他融合蛋白不能被MDPV感染血清所識別。綜合上

5、述試驗結果，MDPV YL08株NS1蛋白的B細胞線性抗原表位區(qū)位于NS1蛋白的羧基末端481～627 aa。Dot-ELISA試驗結果表明融合蛋白NS(501-530)的抗原性最強。
　　以純化的融合蛋白NS(501-530)為包被抗原建立了間接ELISA檢測方法。確定了滅活疫苗免疫番鴨和自然感染番鴨的臨界值為0.300。對240份陽性血清進行檢測，陽性符合率為100％。對100份陰性血清進行檢測，檢測結果為:30份健康番鴨血清

6、中有1份的檢測值略高于臨界值;70份滅活疫苗免疫血清中有1份的檢測值略高于臨界值，檢測準確率為98.0％。本研究建立的ELISA檢測方法與鴨瘟病毒(Duck plaguevirus，DPV)，鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）和鴨呼腸孤病毒(duckreovirus，DRV)等陽性血清無交叉反應。敏感性試驗結果表明，該ELISA檢測方法的敏感性優(yōu)于中和實驗。ELISA的板內及板間變異系數(shù)均小于10％，重復性較

7、好。對含有抗原表位NS(501-530)的重組蛋白抗體消長規(guī)律分析表明，重組蛋白抗體在番鴨感染MDPV后第1周即可檢測到，第3周達到最高峰，以后效價開始略有下降，一直可持續(xù)到第12周。上述實驗結果可證明該ELISA檢測方法可應用于MDPV滅活疫苗免疫番鴨和MDPV自然感染番鴨的鑒別診斷。
　　本研究建立的基于NS蛋白抗原表位的ELISA檢測方法，為MDPV的快速診斷、疫情監(jiān)測、流行病學調查和免疫抗體效價測定提供了一定的技術支持。特