1、內(nèi)皮細(xì)胞的遷移是血管生成的重要啟動(dòng)過(guò)程.多種血管生長(zhǎng)因子如:內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF),肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移.細(xì)胞內(nèi)鞘氨醇激酶(SPK)是催化鞘氨醇生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)的限速酶.S1P是具有很強(qiáng)促血管生成活性的脂類分子,通過(guò)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外兩種機(jī)制參與細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié).細(xì)胞內(nèi)S1P可以作為第二信使參與血管生成信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo).分泌到細(xì)胞外S1P與細(xì)胞膜表面的特異G蛋白偶聯(lián)受體—內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(ED

2、G)結(jié)合,調(diào)節(jié)或激活多種細(xì)胞遷移信號(hào).因此,SPK是細(xì)胞遷移活動(dòng)中的重要信號(hào)分子.多種細(xì)胞因子通過(guò)不同的信號(hào)途徑激活細(xì)胞內(nèi)的SPK.HGF,又稱擴(kuò)散因子(SF)具有非常強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的作用.我們的研究證明HGF和受體c-Met相互作用可以激活內(nèi)皮細(xì)胞的SPK,但是,SPK在HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移中的作用并不清楚.為此,我們構(gòu)建并制備了攜帶人SPK野生型和突變體基因的重組腺病毒載體,利用腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法將SPK野生型基因或其突

3、變體導(dǎo)入內(nèi)皮細(xì)胞,評(píng)價(jià)了SPK在HGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移中的作用.我們利用Bgl Ⅱ、Not Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)將全長(zhǎng)SPK基因(SpKWT)及突變體SPK基因(SPKG82D)克隆至Ad-Easy腺病毒系統(tǒng)的穿梭載體Pshuttle-cmv,獲得Pshuttle-cmv-SPKWT及Pshuttle-cmv-SPKG82D;利用內(nèi)切酶將其線性化后,轉(zhuǎn)化BJ-AD-1感受態(tài)細(xì)胞,獲得Re-ad-SPKWT及Re-ad-SPKG82D腺病毒

4、重組質(zhì)粒.經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定正確后,利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法,將Re-ad-SpKWT及Re-ad-SPKG82D轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,獲得重組腺病毒rAd-SPKWT及rAd-SPKG82D;在293細(xì)胞中分別擴(kuò)增rAd-SPKWT及rAd-SPKG82D純化病毒;以噬斑分析法測(cè)定病毒感染梯度.獲得了攜帶SPK基因的重組腺病毒.內(nèi)皮細(xì)胞ECV304表達(dá)HGF的受體c-Met.同時(shí)表達(dá)S1P的受體EDG,因此是研究HGF與SPK關(guān)系的理想模

5、型.我們利用細(xì)胞擴(kuò)散盒技術(shù)確定了HGF誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞遷移的作用.另外,HGF和c-Met結(jié)合可以激活細(xì)胞內(nèi)SPK的活性.我們分別利用攜帶SPK野生型基因和突變體基因的重組腺病毒感染ECV304細(xì)胞.發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)野生型SPK基因過(guò)表達(dá)可明顯增強(qiáng)HGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移;而表達(dá)SPK突變體基因阻斷內(nèi)源性SPK酶的活性則可以抑制HGF誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞的遷移.研究結(jié)果表明,SPK參與調(diào)控HGF/c-Met誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).