1、丹參Salvia miltiorrhiza Bunge,屬唇形科（Lamiaceae）鼠尾草屬(Salvia Linn)，是重要的藥用植物。丹參使用歷史悠久，最早記錄見于距今兩千多年的《神農本草經》，被列為上品，用于治療心腦血管等諸多疾病。丹參主要有效成分為：水溶性的丹酚酸類和脂溶性的丹參酮類，其中丹參酮屬于二萜醌類。為了弄清丹參酮生物合成途徑，本研究以丹參基因組數(shù)據(jù)為基礎，經過基因克隆、基因結構分析和表達模式分析以及遺傳轉化等手段，對

2、丹參次生代謝相關基因類貝殼杉烯合酶基因SmKSL3和轉錄因子SmSPL進行了研究，并利用T-DNA插入激活標簽載體構建丹參突變體庫以期尋找到更多與次生代謝相關的基因。基于分析和實驗取得了如下的結果：
　　1、丹參SmKSL3基因克隆與表達調控分析
　　在丹參基因組數(shù)據(jù)中，經過與SmKSL1及擬南芥等模式植物的KSL基因進行同源比對，推測基因組中的一個長285bp的contig為丹參KSL基因片段，據(jù)此設計引物、運用RACE及

3、RT-PCR技術首次克隆得到編碼區(qū)全長1245bp的另一個與丹參酮合成相關的重要基因：SmKSL3。
　　基因結構分析表明：SmKSL3含有5′端的非翻譯區(qū)（5′UTR）208bp,在3′端有明顯的polyA結構，顯示出完整的基因結構，其編碼區(qū)長1245bp,蛋白質分子式為C2123H3321N565O638S24，含有414個氨基酸，屬疏水性不穩(wěn)定蛋白。經保守域（conserve domain）、跨膜區(qū)、二級結構及立體結構等生信

4、分析，推測SmKSL3屬于I類丹參合酶，參與催化GPP、FPP或GGPP環(huán)化形成單萜、倍半萜或二萜尤其是萜烯的合成。將序列相似度較高的9種植物KSL基因與SmKSL1和SmKSL3進行系統(tǒng)進化樹分析，顯示丹參SmKSL1和SmKSL3基因與其他物種相似的基因在遺傳上都有一定距離。這些物種都不作為藥用植物，據(jù)此可推知丹參作為藥用植物，其有效成分、次生代謝物的生物合成可能有不同的下游途徑。
　　構建了SmKSL1-GFP和SmKSL3

5、-GFP融合表達載體，用農桿菌介導轉化煙草，經激光共聚焦顯微鏡觀察其瞬時表達情況，發(fā)現(xiàn)SmKSL3-GFP定位于細胞質，而SmKSL1-GFP定位于葉綠體?；虮磉_模式分析顯示SmKSL1和SmKSL3均在根中高表達，對外施茉莉酸甲酯（JA）有響應：SmKSL1在36h時表達顯著升高，SmKSL3則在24h時顯著升高。據(jù)此推測SmKSL1和SmKSL3均可能參與丹參次生代謝過程，并且在時間和空間上是相對獨立的：SmKSL1定位于質體，主

6、要參與質體途徑合成萜類，而SmKSL3缺少N-端的細胞器定位信號，主要在細胞質中發(fā)揮作用。SmKSL1和SmKSL3在不同的時間點響應外界刺激，對生物體具有重要的生理作用。
　　為后續(xù)深入研究SmKSL1和SmKSL3的功能，構建了原核表達載體，并在大腸桿菌中成功表達出蛋白質并純化，蛋白純度均>90％。將SmKSL3與含兩個CaMV35S強啟動子的PBI121載體連接構建了SmKSL3過表達載體。另外利用人工小RNA技術構建了Sm

7、KSL3-artificial miRNA敲減載體。兩種載體均用農桿菌介導進行丹參的遺傳轉化，經初步鑒定獲得過表達SmKSL3的轉基因丹參植株3株和SmKSL3 knock-down的轉基因丹參植株6株。為進一步深入研究SmKSL3的功能、揭示SmKSL1和SmKSL3的功能分工奠定了堅實基礎。
　　2、丹參SmSPL轉錄因子的克隆與調控及功能分析
　　功能的T-DNA插入載體PBI-intron-GUS-4Enhancer

8、，用此載體轉化丹參建立丹參
　　體系，并獲得插入突變陽性植株，其中1株具有明顯表型。為發(fā)現(xiàn)和研究丹參次
　　生代謝相關新基因奠定了基礎。
　　突變體庫。在此過程中，除了用已報道的遺傳轉化方法，我們用鏈霉素
　　SPL（SQUAMOSA promoter binding protein-likes）是植物特有的一類轉錄因子，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要調控作用。通過對丹參基因組序列的分析、比對，預測出15個SmSP

9、L基因，隨后利用RACE和RT-PCR法對它們進行了分子克隆。序列測定和分析結果表明，丹參SmSPL具有多樣化的序列特征和基因結構。丹參SmSPL基因均含有SBP結構域，大多與兩個鋅指結構（CX4CX16CX2H和CX4CX16CX2C）相重合。比較分析表明丹參SmSPL和對應的擬南芥AtSPL之間具有序列的保守性。將丹參SmSPL和擬南芥AtSPL進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)丹參SmSPL可分為6個組。同一組或同一亞組內的SPL往往含有相同的m

10、otif，暗示這些SPL的功能可能是相近或冗余的。如：AtSPL8與花青素和赤霉素的生物合成等有關，二者與次生代謝密切相關，而SmSPL12與AtSPL8同屬一組，暗示SmSPL12也有可能參與丹參花青素形成等次生代謝過程。另外經預測發(fā)現(xiàn)8個丹參SPL是miR156/157的靶基因。用改良的5′-RACE方法驗證了miR156/157的靶基因和切割位點。
　　丹參SPL基因在不同組織中差異表達。受miR156/157調控的那些丹參

11、SPL（SmSPL2,SmSPL3,SmSPL5,SmSLP6,SmSPL8,SmSPL11,SmSPL14,SmSPL15）的表達量隨著丹參植株的成熟而升高，然而在此過程中，miR156/157的表達量下降。這一方面證實了miR156/157對SmSPL基因的調控作用，另一方面也表明SmSPL在丹參發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。此外，丹參植株成熟過程中，miR156/157的表達與miR172的表達呈負相關。miR156、miR172和SP

12、L主要調控植物從營養(yǎng)生長向生殖生長過渡的時間。這種生長階段的轉變對于植物次生代謝物的積累有重大的影響。我們獲得的這些結果暗示了SmSPL、miR156和miR172介導的調控網絡在丹參發(fā)育階段調控中的重要性和復雜性。
　　3、T-DNA插入激活標簽突變體庫的構建
　　為了發(fā)現(xiàn)更多參與丹參次生代謝途徑的基因，構建了兼有激活標簽和基因捕獲功能的T-DNA插入載體PBI-intron-GUS-4Enhancer，用此載體轉化丹參建