1、前言與目的： 神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma，NB)是兒童最常見的顱外惡性實體腫瘤。臨床表現(xiàn)多樣，根據(jù)發(fā)病年齡，腫瘤部位，范圍，生物學(xué)等的不同，預(yù)后差別很大。在治療上，NB的治療主要包括手術(shù)、化療、放療和生物治療，以及在某些慎重選擇情況下的單純觀察等。治療的強度主要根據(jù)高、中、低風(fēng)險的不同有所差別。盡管采取了多種治療手段，高風(fēng)險組的5年生存率仍然低于40％。目前化療在NB的治療中仍起著關(guān)鍵作用，人們一直在探索新的有效化

2、療方案。 近20年來，喜樹堿及其衍生物由于具有獨特的DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ，TopoⅠ)抑制能力，在腫瘤化療領(lǐng)域開始廣泛應(yīng)用。有文獻報道，由于未分化的NB比神經(jīng)節(jié)母細胞瘤及正常腎上腺組織具有更高的TopoⅠ活性，TopoⅠ也是NB治療的新靶點。伊立替康(CPT—11，Irinotecan，IRN)為TopoⅠ抑制劑，又是作用于微管蛋白合成的藥物，為細胞周期S期特異性藥物，目前主要用于結(jié)腸癌等的治療。幾年

3、來的臨床前研究和臨床試驗結(jié)果表明，IRN在NB中有一定療效。 化療一直是以直接殺傷腫瘤細胞，抑制腫瘤細胞生長為目標。近些年發(fā)現(xiàn)一些細胞毒性化療藥物低劑量、短間隙或持續(xù)給藥可以選擇性地抑制腫瘤組織內(nèi)新生血管內(nèi)皮細胞的生長，使腫瘤細胞因為血供不足而生長受阻因而現(xiàn)出明顯的抗腫瘤血管生成作用，從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，這種低劑量，節(jié)律性(low dose metronomics，LDM)化療，也叫抗血管生成化療。這種給藥模式，除了有效抑制

4、血管內(nèi)皮細胞的增殖，也可以在很大程度上避免化療的毒副作用，如骨髓抑制，肝腎功能損害，消化道反應(yīng)及耐藥性產(chǎn)生等，從而增加患者的依從性，提高生活質(zhì)量(Quality of life，QOF)，延長生存時間。在NB領(lǐng)域，由于血管生成和更具侵襲性的臨床表型相關(guān)，而且促進血管生成的分子似乎在高風(fēng)險腫瘤中不同程度表達，臨床前試驗中應(yīng)用抗血管生成藥物治療NB取得了不同程度地成功。目前，關(guān)于抗血管生成治療藥物和其他化療藥物及治療方式配伍的研究也越來越多

5、。LDM化療給藥方式基于其抗血管生成的作用機制，在NB的治療中，極有可能在和其他藥物和治療方式聯(lián)合應(yīng)用的時候，達到藥效增強，同時又被很好耐受。環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CPS，CTX)是目前研究的最多的LDM化療藥物，也是治療NB的常用化療藥物。 根據(jù)我們以往的研究和國外文獻報道，TopoⅠ抑制劑拓撲替康和CTX聯(lián)合應(yīng)用治療NB取得了一定的療效。IRN和拓撲替康是同一類化療藥物，具有比拓撲替康更輕的血液學(xué)毒性。

6、因此，本實驗擬在體外培養(yǎng)NB細胞KCNR和建立KCNR裸鼠皮下移植瘤模型，應(yīng)用IRN和CTX傳統(tǒng)最大耐受量(Maximum Tolerated Dose，MTD)給藥方式或LDM給藥方式進行治療，觀察單藥和聯(lián)合用藥的毒性、療效和進行初步機制探討。并且在細胞實驗和動物實驗基礎(chǔ)上，結(jié)合國外相關(guān)臨床試驗結(jié)果，征得倫理委員會及患者或家屬同意，臨床上應(yīng)用IRN和CTX LDM化療治療復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移難治性NB，觀察化療毒性、療效及進行患者QOF評價，初步

7、明確NB晚期患者是否可以從該化療中獲益。 方法： 1.體外培養(yǎng)NB細胞系KCNR細胞，應(yīng)用MTT法檢測IRN(SN—38)與CTX(4—HC)單藥及聯(lián)合應(yīng)用對NB的細胞毒作用。 2.建立NB細胞系KCNR裸鼠皮下移植瘤動物模型。應(yīng)用不同劑量及給藥方式CTX，IRN及兩藥聯(lián)合應(yīng)用治療2療程。每周測量2次裸鼠體重及腫瘤體積，做腫瘤生長曲線，當裸鼠體積大于1500mm3，殺死裸鼠，記錄死亡時間，做Kaplan—Meie

8、r生存曲線，進行生存分析。取治療后腫瘤標本，應(yīng)用TUNEL法檢測凋亡，分別應(yīng)用免疫組化(immunohistochemistry，IHC)及Wester—blot檢測CD31及VEGF表達。 3.臨床上，選擇復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移難治性晚期NB患者，應(yīng)用IRN單藥或者IRN聯(lián)合小劑量CTX持續(xù)口服進行治療，觀察毒性反應(yīng)；評價療效，統(tǒng)計臨床獲益率(Clinical Benefit Response Rate，CBR)；評價QOF。 4.

9、對實驗結(jié)果應(yīng)用Students t檢驗等進行統(tǒng)計分析并對生存曲線進行l(wèi)og—rank檢驗比較分析，P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.SN—38(IRN)和/或4—HC(CTX)對KCNR細胞具有細胞毒作用。聯(lián)合用藥組與單藥組組間存在顯著性差異(P<0.01)。 2.不同劑量及給藥方式CTX及IRN單藥均可不同程度的抑制KCNR裸鼠皮下移植瘤的生長，延長生存時間。聯(lián)合應(yīng)用IRN及MTD CTX或LDM C

10、TX都比單一用藥起到更好的治療作用，兩種聯(lián)合用藥方式療效無顯著性差異。聯(lián)合用藥組與單藥組組間差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。但是IRN和MTD CTX聯(lián)合應(yīng)用出現(xiàn)了實驗動物藥物相關(guān)性死亡和體重明顯下降，不能被很好耐受。IRN和LDM CTX聯(lián)合應(yīng)用實驗動物可耐受。凋亡細胞數(shù)目：IRN+CTX—40(LDM)>IRN>CTX—40(LDM)>對照組，但CTX—40(LDM)與對照組凋亡細胞數(shù)目無顯著差異，包含IRN的治療組(單藥及聯(lián)合用

11、藥組)與對照組相比凋亡細胞明顯增多。CD31，VEGF表達：對照組>IRN>CTX—40(LDM)>IRN+CTX—40(LDM)，但IRN與對照組差別不明顯，包含CTX—40(LDM)的治療組(單藥及聯(lián)合用藥組)表達較對照組明顯降低。 3.初步臨床觀察結(jié)果表明，IRN單藥治療晚期NB患者耐受良好，主要副反應(yīng)為血液學(xué)毒性，主要表現(xiàn)為中性粒細胞減少等?？傮w臨床獲益率(Clinical Benefit Rate，CBR)為42.9％