1、目的：通過CCl<,4>誘導(dǎo)的HF (hepatic fibrosis，HF)大鼠模型，觀察MT對模型大鼠肝臟病理學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢查、HF指標(biāo)的作用；鑒于肝星狀細(xì)胞 (hepatic stellatecells，HSC)在HF中的核心作用，通過體外實(shí)驗(yàn)，初步探討MT和M膽堿受體激動劑硝酸毛果蕓香堿(pilocarpine nitrate，PN)拮抗劑硫酸阿托品(atropine sulfate，AS)對HSC形態(tài)學(xué)、合成或分泌細(xì)胞外基質(zhì)

2、、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)行為的影響，以期今后進(jìn)一步研究MT、PN、AS對HF作用機(jī)制，并為開發(fā)治療HF的藥物提供實(shí)驗(yàn)室依掘。 方法：予SD大鼠背部皮下注射CCl<,4>制備HF模型。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：MT組大鼠灌胃，給予MT (0.125、0.5、2.0 mg/(kg·d))8 wk，全自動生物化學(xué)分析儀 (automaticbiochemical analyzing equipment，A-BAE) 檢測生化指標(biāo)，放射免疫分析法(

3、radioimmunoassay,RIA) 檢測血清透明質(zhì)酸 (hyaluronic acid，HA) 與Ⅲ型前膠原(precollagen type Ⅲ，PCⅢ)，HE染色觀察病理改變； 體外實(shí)驗(yàn)：從HF模型組來源的HSC給予MT(10、0.1μmol/L、l nmol/L)，PN(1 mmol/L、10、0.1 μmol/L)，AS(1 mmol/L、10、0.1 μmol/L)，MT(10μmol/L)+PN(1 mmol

4、/L、10、0.1μmol/L)，MT(10 μmol/L)+AS(1 mmol/L、10、0.1μmol/L)；從正常組來源的HSC給予生理鹽水。培養(yǎng)48 h后，光鏡下觀察細(xì)胞爬片后HSC形態(tài)學(xué)改變；流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)檢測HSC凋亡率，RIA檢測培養(yǎng)上清中HA、PCⅢ水平。從HF模型組來源的HSC給予PN(10μmol/L)，MT(10 μmol/L)+PN(10 μmol/L)，MT(0.1 μmol/

5、L)+PN(10μmol/L)，陰性對照組給予等劑量無血清DMEM，培養(yǎng)48h后，逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (reverse transcriptase polymerase chainreaction，RT-PCR)檢測Ⅰ型膠原mRNA(collagen typeⅠmRNA，ColⅠmRNA)表達(dá)。 結(jié)果： 1.MT對CCl<,4>誘導(dǎo)的HF大鼠實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)、HF指標(biāo)、肝臟病理的影響 1.1 MT對CCl<,4

6、>誘導(dǎo)的HF大鼠實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的影響 CCl<,4>造模12 wk后，與正常組大鼠比較，HF模型組大鼠TP、ALB含量顯著減少、A/G顯著降低，ALT、AST和ALP含量均顯著增加。與HF模型組大鼠比較，CLC組大鼠ALB顯著增加、A/G升高，ALT和ALP均顯著降低；MT(0.5 mg/(kg·d)，8 wk)組大鼠TP增加，MT各劑量組大鼠ALB顯著增加、A/G升高，ALT、AST和ALP均顯著降低。與CLC組大鼠比較，MT

7、(0.5 mg/ (kg·d)，8 wk)組TP、ALB顯著增加(p<0.05)；MT(2.0 mg/(kg·d)，8 wk)組ALT水平較高(p<0.05)。 1.2 MT對CCl<,4>誘導(dǎo)的HF大鼠HF指標(biāo)的影響 CCl<,4>造模12 wk后，與正常組大鼠比較，HF模型組大鼠HA、PCⅢ水平明顯升高；與HF模型組大鼠比較，CLC組、MT各劑量組大鼠HA、PCⅢ水平明顯降低；與CLC組比較，MT高劑量組HA水平較高

8、，而中劑量組的較低。 1.3 MT對CCl<,4>誘導(dǎo)的HF大鼠肝臟病理的影響 CCl<,4>造模12 wk后，與正常組大鼠比較，HF模型組大鼠肝細(xì)胞皺縮、腫脹、壞死，界限不清，細(xì)胞排列紊亂，可見脂肪變性改變；纖維組織增生并穿插進(jìn)入肝細(xì)胞間隙，炎性細(xì)胞浸潤及血管翳形成。CLC組、MT各劑量組均可不同程度改善病理改變。 2．MT、PN、AS對的HSC形態(tài)學(xué)影響 體外用藥培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，正常大鼠來源的正常

9、對照組HSC幾乎鋪滿爬片；與正常對照組HSC比較，HF大鼠來源的模型組HSC幾乎鋪滿爬片，生長良好；與模型組比較，MT各劑量組HSC稀疏，AS各劑量組部分細(xì)胞皺縮， MT與AS聯(lián)合用藥組HSC稀疏，部分細(xì)胞皺縮；而PN各劑量組HSC稠密鋪滿爬片，生長良好；MT與PN聯(lián)合用藥組HSC幾乎鋪滿爬片，生長較好，可見少量細(xì)胞皺縮。 3．MT、PN、AS對HSC凋亡的影響 細(xì)胞體外用藥48 h后，與正常對照組HSC比較，模型組HS

10、C凋亡率明顯增加；與模型組比較，MT(10 μmol/L)，PN、AS各劑量組，MT(10 μmol/L)+AS(10、0．μtmol/L) 凋亡率顯著增加(P<0.05)，MT (10μmol/L)+PN(10μmol/L)組凋亡率顯著降低(P<0.05)。 4．MT、PN、AS對HSC合成或分泌HA、PCⅢ的影響 細(xì)胞體外用藥48 h后，與正常對照組HSC比較，模型組HSC中HA、PCⅢ水平明顯升高；與模型組比較，M

11、T、AS各濃度組、MT與AS聯(lián)合用藥組HA、PCⅢ水平顯著降低；而PN、MT與PN聯(lián)合用藥組HA水平顯著升高，PCⅢ水平無明顯差異。 5．MT、PN對HSC表達(dá)ColⅠmRNA的影響 PN促進(jìn)HSC表達(dá)ColⅠmRNA，而MT能夠抑制PN的促進(jìn)作用。 結(jié)論： 1．MT對CCl<,4>誘導(dǎo)的大鼠HF損傷有明顯改善作用，能有效保護(hù)肝臟。 本課題實(shí)驗(yàn)成功建立了CCl<,4>誘導(dǎo)的大鼠化學(xué)性損傷模型，以體

12、內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證明了在HF時(shí)，MT不同劑量(0.125、0.5、2.0 mg/(kg·d)，8 wk)能不同程度升高反映肝臟合成功能的蛋白質(zhì)(TP、ALB)水平，降低反映代謝功能的肝功能酶(AST、ALT、ALP)水平；減少反映HF的血清HA、PCⅢ含量；MT不同劑量均能有效改善肝臟病理損傷。結(jié)果充分說明了MT能夠在肝臟功能、形態(tài)等方面發(fā)生損傷情況下，改善甚至逆轉(zhuǎn)肝臟損傷。同時(shí)，病理學(xué)等結(jié)果提示，MT在中劑量(0.5 mg/(kg·d)，8

13、wk)時(shí)，可有效保護(hù)肝臟。 2.MT可能通過誘導(dǎo)HSC凋亡、抑制HSC合成或分泌HA、PCⅢ等機(jī)制發(fā)揮抗HF作用。 本課題實(shí)驗(yàn)，結(jié)合體內(nèi)、體外兩種環(huán)境，探討了MT對反映HF時(shí)ECM改變的指標(biāo)HA、PCⅢ的影響；證實(shí)了M丁在體內(nèi)外均能夠有效降低HA、PCⅢ水平，并在體外抑制PN的促進(jìn)ColⅠmRNA表達(dá)作用，提示MT在影響HSC合成或分泌ECM階段，發(fā)揮抗HF作用；同時(shí)，觀察了MT對HSC凋亡作用，證實(shí)MT(10 μmol

14、/L)能顯著促進(jìn)HSC凋亡，應(yīng)當(dāng)是MT能改善HF的主要機(jī)制：此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示，MT抑制HSC合成或分泌ECM作用，并不完全依賴誘導(dǎo)HSC凋亡作用，在較高濃度范圍內(nèi)，才表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)：而在較低濃度時(shí)，已能抑制HSC合成或分泌ECM。 3.M膽堿能受體激動劑PN、拮抗劑AS參與了對HSC凋亡、合成或分泌ECM的調(diào)控。 體外實(shí)驗(yàn)中觀察了M膽堿能受體激動劑PN、拮抗劑AS對HSC的影響，發(fā)現(xiàn)PN不同濃度(1 mmo

15、l/L、10、0.1μmol/L)均能促進(jìn)HSC合成或分泌HA，PN(10 μmol/L)還能促進(jìn)ECM中重要成分Col Ⅰ的mRNA表達(dá)，有力佐證了PN能夠促進(jìn)HSC增殖，同時(shí)引起凋亡活動相應(yīng)活躍；拮抗劑AS(1 mmol/L、10、0.1μmol/L)能夠有效減少HA、PCⅢ含量，并引起HSC凋亡增加。結(jié)合M膽堿能受體激動劑PN、拮抗劑AS的作用，證實(shí)兩者參與了對HSC凋亡、合成或分泌ECM的調(diào)節(jié)，并提示影響M膽堿能受體，可以調(diào)控H