1、近年來(lái)，葡萄糖氧化酶(簡(jiǎn)稱GOD)的用途越來(lái)越多，需求量也越來(lái)越大。而目前其生產(chǎn)主要采用胞內(nèi)表達(dá)的發(fā)酵體系，大多數(shù)存在生產(chǎn)成本偏高，產(chǎn)出蛋白純度不夠高，產(chǎn)量偏低等問(wèn)題。因此，借助基因工程手段構(gòu)建優(yōu)良的GOD產(chǎn)生菌株，并讓它有效的高表達(dá)，具有重要意義。
　　本論文采用巴斯德畢赤酵母（菌株GS115）做為表達(dá)菌種。巴斯德畢赤酵母的表達(dá)系統(tǒng)分胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外兩種方式，所用發(fā)酵培養(yǎng)基簡(jiǎn)單有利于分離純化，可以用甲醇做為一般碳源嚴(yán)格地調(diào)控

2、外源基因的表達(dá)。所以本實(shí)驗(yàn)用SacⅠ內(nèi)切酶鑒定所保存的真核分泌型表達(dá)載體質(zhì)粒pPIC9K-His-GOD是否正確，重組質(zhì)粒pPIC9K-His-GOD轉(zhuǎn)化大腸桿菌擴(kuò)增，提取并純化。pPIC9K-His-GOD用BlgⅡ內(nèi)切酶線性化，電激轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115，以期得到高分泌易于純化的酵母工程菌株，提取核DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增確定是否轉(zhuǎn)化成功。將得到的菌種做發(fā)酵表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)。
　　本論文取得的結(jié)果主要有:

3、>　　1重組質(zhì)粒pPIC9K-His-GOD轉(zhuǎn)化大腸桿菌:選擇SacⅠ內(nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒，檢測(cè)保存的酵母表達(dá)載體pPIC9K-His-GOD，將得到的目的片段載入大腸桿菌通過(guò)堿裂解法和PEG純化方法以獲得高純度的重組質(zhì)粒pPIC9K-His-GOD。
　　2重組質(zhì)粒pPIC9K-His-GOD電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115:根據(jù)酵母表達(dá)體系，將純化的重組質(zhì)粒pPIC9K-His-GOD用BlgⅡ線性化并電激轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115

4、，將目的基因整合到畢赤酵母染色體上。通過(guò)基因組PCR法進(jìn)行驗(yàn)證是否整合，確定12個(gè)菌株基因組中有GOD基因整合。利用遺傳霉素G-418篩選能穩(wěn)定含有GOD基因的多拷貝酵母菌株，命名為p.PIC9K-GS115-GOD04。
　　3巴斯德畢赤酵母GS115的發(fā)酵表達(dá):根據(jù)畢赤酵母的特點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)，應(yīng)用甲醇做為唯一碳源和能源做誘導(dǎo)表達(dá)，之前實(shí)驗(yàn)室保存的黑曲霉基因組的GOD序列的5'端加有編碼6個(gè)組氨酸的基因序列，故發(fā)酵后上清用