1、沙門菌(Salmonella)可以通過污染食物感染人和動物，引起多種人和動物的急性或慢性傳染病，是一種在公共衛(wèi)生學上具有重要意義的人畜共患病原菌。在世界各地的食物中毒病例中，沙門菌引起的中毒病例占首位或第二位，嚴重威脅著人類的身體健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展。目前許多發(fā)達國家諸如美國都已建立了相對完善的沙門菌流行病學監(jiān)測和耐藥監(jiān)控體系，流行病學數(shù)據(jù)較為豐富，同時也開展了較深入的耐藥機制研究，而我國在這方面的研究還比較滯后。為了了解動物沙門菌的

2、流行情況和藥物敏感性，以及對氟苯尼考的耐藥機制。本研究對臨床上疑似沙門菌病的病料進行病原分離和細菌的多重PCR鑒定，選取臨床分離株S101022、0605E2-H，并針對floR、AcrB兩個耐藥基因，采用λ-Red同源重組法構(gòu)建相應(yīng)的基因缺失株，初步探討了這兩個耐藥基因與氟苯尼考耐藥的關(guān)系，為進一步深入研究沙門菌氟苯尼考耐藥的分子機制奠定了基礎(chǔ)。
　　1.沙門菌的分離鑒定及耐藥性分析
　　對臨床上疑似沙門菌病的病料進行病原

3、分離和細菌的多重PCR鑒定，共分離到沙門菌61株，其中腸炎沙門菌10株，雞白痢沙門菌12株，鼠傷寒沙門菌39株，月份分布顯示，7～8月分離率最高。K-B法測定分離株對23種抗菌藥物的敏感性以及部分藥物的MIC結(jié)果顯示，動物源沙門菌耐藥性總體呈現(xiàn)上升趨勢，所有菌株對青霉素、紅霉素、萬古霉素耐藥，90.16％對6種及其以上抗菌藥耐藥。選擇氟苯尼考耐藥菌株擴增floR、fexA、fexB等基因，結(jié)果顯示，8株攜帶floR，其他基因未檢測到，對

4、克隆的floR基因的核苷酸序列進行分析，與Genbank中已報道動物源性沙門菌floR基因核苷酸序列比較，發(fā)現(xiàn)同源性在99.3％～100％，氨基酸序列的同源性在99.2％～100％，分別在147、160、228、293位發(fā)生了氨基酸的替代。
　　2.氟苯尼考相關(guān)耐藥基因缺失株的構(gòu)建及其耐藥表達研究
　　選取都柏林沙門菌S101022、鼠傷寒沙門菌0605E2-H，針對不同耐藥基因floR、AcrB，使用λ-Red同源重組法，

5、構(gòu)建6個耐藥基因缺失株，PCR擴增以及突變株序列測序結(jié)果顯示6個基因突變株構(gòu)建成功。采用第一章中的方法測定相應(yīng)缺失株的藥物敏感性，其結(jié)果顯示缺失株對氟苯尼考的耐藥性成功丟失。細菌的生長曲線測定結(jié)果顯示，雙基因缺失株的生長速度略慢于野生株，其余菌株的生長速度并無明顯差異。采用Q-PCR方法對floR、AcrB耐藥基因的表達進行了測量，結(jié)果顯示，floR缺失株無論是否氟苯尼考的選擇壓力下，AcrB的表達量會呈現(xiàn)不同程度的增加，添加CCCP后

6、，AcrB的表達量并沒有顯著差異;而AcrB缺失株在CCCP的選擇性壓力下，floR的表達量卻有了一定程度的升高，證明AcrB的表達對外界環(huán)境改變（尤其是抗生素）有著相關(guān)程度的依賴性，而正常環(huán)境下floR的表達并沒有顯著的差異;AcrB和floR在氟苯尼考耐藥過程中的表達差異并不明顯。
　　3.HPLC法測定氟苯尼考在耐藥和基因缺失株內(nèi)聚集的研究
　　采用HPLC法測定野生株S101022、0605E2-H和基因缺失株S10

7、1022△floR、S101022△AcrB、0605E2-H△floR、0605E2-H△AcrB攝取氟苯尼考的差異，結(jié)果顯示，與floR和AcrB基因缺失株相比，耐藥的野生株S101022和0605E2-H對氟苯尼考的攝取量明顯較少，而在加入氟苯尼考的10min，野生株的氟苯尼考的積聚量約是雙基因缺失株的1/2。而在耐藥過程中加入CCCP和PAβN（一種外排泵抑制劑），發(fā)現(xiàn)CCCP對△AcrB氟苯尼考的積聚量影響較大，對△floR影