1、選取6日齡雄性昆明鼠，人工腦內(nèi)接種狂犬病病毒SRV-9毒株，當(dāng)其出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后，生物安全條件下，無菌采集腦組織，另外還有自然感染犬的腦組織，將每個腦組織一部分用4％多聚甲醛固定，另一部分應(yīng)用套式RT-PCR及直接免疫熒光抗體試驗(yàn)進(jìn)行檢測。 選擇狂犬病病毒N基因保守區(qū)設(shè)計兩對引物，外引物RHN1和RHN4，內(nèi)引物RHN2和RHN3，建立狂犬病毒的套式RT-PCR檢測方法，此方法可以特異地檢測出狂犬病病毒SRV-9毒株的RNA，而對

2、犬細(xì)小病毒(CPV)和犬瘟熱病毒(CDV)均呈陰性。檢測人工腦內(nèi)接種狂犬病病毒SRV-9毒株的乳鼠及自然感染犬的腦組織樣品，凝膠電泳觀察均可以觀察到特異的344bp的條帶。此外，應(yīng)用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗狂犬病病毒單克隆抗體進(jìn)行直接免疫熒光抗體試驗(yàn)，在熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，即為狂犬病病毒抗原。 建立間接免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行狂犬病病毒腦組織中的分布定位研究，優(yōu)化免疫組織化學(xué)方法中的各種條件，通過辛酸-飽和硫酸銨沉淀法、DE

3、AE52纖維素離子交換和蛋白A層析相結(jié)合的方法，制備純化抗體，得到濃度為2.216mg/ml的馬抗狂犬病病毒抗體及濃度為1.452mg/ml兔抗馬IgG抗體，經(jīng)堿性磷酸酶標(biāo)記后，其濃度為0.97mg/ml、Dot-ELISA檢測抗體效價為1：3200。通過反復(fù)試驗(yàn)確定以0.01M PH6.0檸檬酸緩沖液為抗原修復(fù)液，高溫高壓及胰蛋白酶消化法相結(jié)合的抗原修復(fù)方法，一抗及二抗的最佳工作濃度分別為1：50與1：100等為最佳條件，建立了敏感性

4、高、穩(wěn)定性強(qiáng)、可重復(fù)性高的免疫組織化學(xué)方法。 應(yīng)用建立的間接免疫組織化學(xué)方法，與組織病理學(xué)HE染色相比較，對上述10只人工感染狂犬病病毒的乳鼠及8只自然感染犬的腦組織中狂犬病病毒分布定位進(jìn)行研究，得到了較好的效果，組織病理學(xué)HE染色乳鼠腦均未觀察到病毒嗜酸性包涵體，在4只犬腦在小腦蒲肯野氏細(xì)胞胞漿中發(fā)現(xiàn)包涵體。而間接免疫組織化學(xué)方法染色均為陽性，其檢出的陽性率與套式RT-PCR及直接免疫熒光抗體試驗(yàn)相符。腦組織中的病毒抗原在乳鼠