1、隱孢子蟲(chóng)病(Cryptosporidisis)是由隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium)引起的一種以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的呈世界性分布的人畜共患寄生蟲(chóng)病,該病嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和畜牧業(yè)生產(chǎn),也是人類(lèi)艾滋病患者的主要致死因素之一。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心將其列為B類(lèi)病原。2003年該病被列為我國(guó)重點(diǎn)防范的兩種重要寄生蟲(chóng)病之一。近年來(lái),隱孢子蟲(chóng)病研究在病原生物學(xué)、形態(tài)學(xué)、流行病學(xué)、分子生物學(xué)、診斷及綜合防治技術(shù)等方面取得許多重要成果；但是由于隱

2、孢子蟲(chóng)蟲(chóng)種間形態(tài)差異不明顯,國(guó)內(nèi)外又缺少隱孢子蟲(chóng)統(tǒng)一的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),加之近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,隱孢子蟲(chóng)新基因型的報(bào)道不斷出現(xiàn),造成了隱孢子蟲(chóng)種類(lèi)的確切數(shù)目一直不很清楚,這給預(yù)防和控制該病帶來(lái)了極大困難。 本課題旨在通過(guò)對(duì)安徽省四個(gè)奶牛場(chǎng)奶牛隱孢子蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查,以便初步摸清安徽省奶牛隱孢子蟲(chóng)感染情況；從陽(yáng)性奶牛糞樣中分離隱孢子蟲(chóng)卵囊,并采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)所獲卵囊進(jìn)行鑒定,試圖從分子水平上探明安徽省奶牛源隱孢子蟲(chóng)蟲(chóng)

3、種類(lèi)型,為人畜共患隱孢子蟲(chóng)病的防控提供理論依據(jù)。 首先采用飽和白糖溶液漂浮法對(duì)安徽省四個(gè)奶牛場(chǎng)502份奶牛糞樣進(jìn)行檢測(cè),其中在D場(chǎng)糞樣中未檢出隱孢子蟲(chóng)卵囊。而在A、B和C 3個(gè)場(chǎng)糞樣中檢出了隱孢子蟲(chóng)卵囊。根據(jù)所獲卵囊的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)、卵形指數(shù)等特征,初步鑒定安徽省奶牛源隱孢子蟲(chóng)為安氏隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium andersoni)。經(jīng)顯著性檢驗(yàn),B場(chǎng)的奶牛隱孢子蟲(chóng)的感染率極顯著的高于C場(chǎng)(P<0.01);而A和B

4、兩個(gè)場(chǎng)的奶牛隱孢子蟲(chóng)感染率差異也極顯著(P<0.01)。4個(gè)場(chǎng)的感染率范圍為0％～14.79％,平均感染率為5.18％。對(duì)不同年齡段奶牛隱孢子蟲(chóng)感染率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析后發(fā)現(xiàn)：犢牛與青年牛之間隱孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率差異顯著(0.010.05)。 其次對(duì)白糖密度梯度離心純化法,乙醚-飽和硫酸鋅純化法,Sheather's白糖漂浮法等3種隱

5、孢子蟲(chóng)卵囊純化方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明：3種純化方法中,白糖密度梯度離心法純化效果最好,回收卵囊中雜質(zhì)較少,且實(shí)驗(yàn)成本較低。Sheather's白糖漂浮法回收量較高,但由于白糖粘性較大,限制了卵囊與雜質(zhì)的有效分離,造成回收卵囊中雜質(zhì)較多,影響PCR反應(yīng)效果。乙醚-飽和硫酸鋅漂浮法,卵囊回收量和純化效果次于前兩種方法。 再次采用白糖密度梯度離心法對(duì)分離的隱孢子蟲(chóng)卵囊進(jìn)行純化。取純化的卵囊,先加裂解液(2％DTT,1×TE),再將卵囊

6、放入-70℃冰箱反復(fù)凍融三次,提取模板DNA。根據(jù)隱孢子蟲(chóng)18SrRNA序列,設(shè)計(jì)并合成隱孢子蟲(chóng)特異性引物,擴(kuò)增出540 bp的片段。初始PCR產(chǎn)物進(jìn)一步作套式PCR,擴(kuò)增出一條250 bp特異性的片段。根據(jù)隱孢子蟲(chóng)HSP70基因序列,設(shè)計(jì)合成隱孢子蟲(chóng)特異性引物,擴(kuò)增出448 bp條帶,再以此產(chǎn)物做模板進(jìn)行套式PCR,擴(kuò)增出325 bp條帶。最后使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒,對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行回收,純化后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。然后

7、根據(jù)GenBank相關(guān)序列,以DNAStar,MEGA3.1等軟件對(duì)序列進(jìn)行比較分析,構(gòu)建種系進(jìn)化樹(shù),為使結(jié)果盡可能準(zhǔn)確,本次試驗(yàn)采用了鄰近相連法(NJ),最大簡(jiǎn)約法(MP)兩種不同的算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。軟件分析結(jié)果表明,此次所得到的兩種進(jìn)化樹(shù)很相似。從分子水平進(jìn)一步證實(shí)安徽省奶牛源隱孢子蟲(chóng)為安氏隱孢子蟲(chóng)(C.andersoni)。 綜上所述,本課題所獲的結(jié)果為今后安徽省奶牛隱孢子蟲(chóng)病的防治提供了理論依據(jù)；所建立的隱孢子蟲(chóng)分子鑒定方