1、本研究的目的：(1)用pET29b表達載體在大腸桿菌中高表達結核分枝桿菌的RmlA蛋白質；(2)采用親和層析技術純化RmlA蛋白質；(3)用SDS-PAGE和Westernblot鑒定所純化的RmlA蛋白質；(4)建立測定RmlA酶活性的方法；(5)確定RmlA酶的最佳反應條件并測定RmlA酶的反應動力學常數。 本研究所獲得的結果：1.誘導RmlA蛋白質在大腸桿菌BL21(DE3)中表達用不同條件(IPTG濃度、誘導溫度及誘導時

2、間等)誘導rmlA基因的表達。用超聲方法破碎誘導的BL21(DE3)，對上清和沉淀組分進行SDS-PAGE分析。結果表明RmlA酶蛋白在BL21(DE3)中得以表達，并且可以以可溶形式存在于上清中。 2.用Westernblot方法鑒定RmlA蛋白質將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，用抗多聚組氨酸的單克隆抗體及偶聯堿性磷酸酶的馬抗小鼠IgG二抗進行檢測。結果表明，所表達的RmlA蛋白質為rmlA基因產物。

3、 3.采用親和層析技術純化RmlA蛋白質利用pET表達載體上的組氨酸標記，采用組氨酸-Ni2+親和層析技術，純化RmlA蛋白質。并且用考馬斯亮藍法進行蛋白定量，結果表明純化的第1mlRmlA蛋白質的濃度為635.71μg/ml。 4.用SDS-PAGE和Westernblot鑒定所純化蛋白的純度將純化后收集的前3ml樣品進行SDS-PAGE和Westernblot分析，結果表明純化的蛋白質為RmlA蛋白質，而且不存在其它雜蛋

4、白。 5.建立測定RmlA酶活性的方法(1)將反應底物D-Glc-1-P和dTTP與純化的RmlA酶蛋白在37℃反應30分鐘，用500mMKH2PO4終止反應，然后采用高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)，應用C18層析柱，在254nm處檢測到dTTP的減少和dTDP-D-Glc的生成，表明純化的RmlA蛋白質具有酶活性。 (2)將反應底物D-Glc-1-P和

5、dTTP與不同濃度的RmlA酶蛋白在37℃反應不同的時間，用500mMKH2PO4終止反應，然后用HPLC和C18層析柱在254nm處檢測產物dTDP-D-Glc的生成。繪制酶濃度曲線和反應時間進程曲線，結果表明RmlA酶蛋白反應初速度的酶濃度范圍是1.27μg/ml，時間范圍是5min。 (3)在酶反應初速度范圍，即酶濃度為1.27μg/ml，反應時間為5min，分別改變反應溫度(從20℃到90℃)和反應的pH值，用HPLC和

6、C18層析柱檢測產物dTDP-D-Glc的生成量。結果表明RmlA酶蛋白的最適反應溫度是40℃，最適pH值為8.0。 6.測定RmlA酶蛋白的反應動力學常數采用最佳的酶反應條件，即在40℃，pH值為8.0，酶濃度為1.27μg/ml，反應時間為5min，分別用不同的底物濃度，進行酶促反應，然后用500mMKH2PO4終止反應并用HPLC和C18層析柱在254nm處檢測產物dTDP-D-Glc的生成量。用雙倒數作圖法得出RmlA的

7、Km值和Vmax。對于底物dTTP，Km=0.019mmol/L，對于底物D-Glc-1-P，Km=0.870mmol/L。Vmax為160.56mmol/(L·min)。 結論：(1)用大腸桿菌BL21(DE3)所表達的可溶性結核分枝桿菌RmlA蛋白質為純化RmlA蛋白質并研究其酶促反應動力學特性提供了保障。(2)建立了精確的RmlA酶活性測定方法，確定了RmlA的最佳反應條件并測定了RmlA酶蛋白的反應動力學常數Km和Vma