1、<p>　　結(jié)核分枝桿菌furB基因的克隆、表達(dá)和純化</p><p>　　作者：姜泓，薛瑩，高雪，師長(zhǎng)宏，柏銀蘭，張海，李元，徐志凱 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 結(jié)核分枝桿菌 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To obtain Mycobacterium tuberculosis (MTB) furB from H37Rv

2、DNA, express efficiently in E. coli and purify the FurB proteins. METHODS: furB was amplified by PCR from the genome of H37Rv and cloned into pGEMTEasy vector. After sequenced, furB was recombinated into the expression

3、vector pQE80L by restriction enzyme digestion, which was named pQE80LfurB. The plasmid pQE80LfurB was transformed into E.coli DH5α and induced by IPTG. The furB expression was analyzed by SDSPAGE and confir</p>&l

4、t;p>　　【Keywords】 furB; expression; purification; Mycobacterium tuberculosis </p><p>　　【摘要】 目的： 從H37Rv基因組中擴(kuò)增furB并高效表達(dá)和純化. 方法： 用PCR技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中擴(kuò)增furB序列，將其與pGEMTEasy載體連接轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，構(gòu)建重組克隆載體pGEMTEasy/

5、furB，測(cè)序正確后將目的基因片斷克隆入pQE80L原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá). 經(jīng)Western blot鑒定目的基因與(His)6融合表達(dá)，將已表達(dá)的蛋白質(zhì)通過Ni2+NTA親和色譜柱進(jìn)行純化. 結(jié)果： PCR得到結(jié)核分枝桿菌furB，測(cè)序結(jié)果與Genbank中報(bào)道的完全一致. SDSPAGE顯示，在Mr為15.0×103處有相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，Western blot鑒定為(Hi

6、s)6融合表達(dá)蛋白. 經(jīng)Ni2+NTA親和色譜柱進(jìn)行純化后可得到純化的蛋白. 結(jié)論： 成功克隆了鐵調(diào)節(jié)蛋白基因furB序列，并在E.coli DH5α高效表達(dá)，親和層析后獲得了純化目的蛋白. </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 furB;表達(dá);純化;結(jié)核分枝桿菌 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　結(jié)核分枝桿菌（M

7、ycobacterium tuberculosis, MTB）在結(jié)核病(tuberculosis, TB)患者體內(nèi)的生長(zhǎng)與鐵的利用有關(guān). 研究發(fā)現(xiàn)，MTB基因組包含了兩個(gè)相似的鐵攝取基因furA和furB. furA主要與其下游的katG基因表達(dá)有關(guān), 而furB的功能現(xiàn)在還不清楚．為此，我們?cè)谠吮磉_(dá)載體中表達(dá)MTB furB并對(duì)其進(jìn)行了純化，為其功能研究奠定基礎(chǔ). </p><p><b>　　1材

8、料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p><p>　　MTB毒株H37Rv, DH5α由本室保存; pGEMTEasy及Wizard Plus Purification system購(gòu)自Promega公司； Xgal, 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ, HindⅢ及T4DNA連接酶，TaqDNA聚合酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；I

9、PTG, DTT, DTE,小量質(zhì)粒提取試劑盒均為Sigma公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒為Vitagene公司產(chǎn)品. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p>　　1.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已發(fā)表的MTB H37Rv全基因組furB編碼區(qū)(2641648N,2642040C)序列設(shè)計(jì)引物. 上游引物P1: 5′GGATCCAGTGCAGCCGG

10、TGTCCGC3′中加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物P2: 5′AAGCTTCCTTTTGGTGCTGGAGACGG3′ 中加入HindⅢ酶切位點(diǎn). 引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成. </p><p>　　1.2.2furB片段的擴(kuò)增取保存于改良羅氏培養(yǎng)基的MTB H37Rv接種于7H9液體培養(yǎng)基，37℃間或振蕩培養(yǎng)2~3 wk. 取5 mL液體培養(yǎng)物的菌體沉淀重懸于50 μL裂解液（10×PCR綬

11、沖液5 μL, 45 g/L吐溫5 μL, 45 g/L NP40 5 μL, 20 g/L蛋白酶K 0.5 μL及水34.5 μL）中. 于55℃水浴1 h，沸水浴10 min滅活蛋白酶K，離心取上清，用酚/氯仿抽提，無(wú)水乙醇沉淀，溶于50 μL TE中［1］,作為DNA模板. PCR反應(yīng)體系為： 10×buffer 5 μL, dNTPs 5 μL (2.5 mmoL/L)、DNA模板為1 μL, P1, P2引物各1

12、μL (25 μmoL/L)及Taq酶1 μL，加水至50 μL. PCR條件: 94℃變性40 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸50 s, 25個(gè)循環(huán). </p><p>　　1.2.3PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收DNA條帶. 取純化的PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pGEMTEasy進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α, 均勻涂布于含有xgal(33 μL) 和異丙基βD硫代半乳糖苷IPTG(20

13、μL)的LB培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)16 h, 挑取白色菌落進(jìn)行酶切鑒定，所獲陽(yáng)性克隆命名為pGEMTEasyfurB，送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定. </p><p>　　1.2.4目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的pQE80L載體進(jìn)行連接反應(yīng)， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取的陽(yáng)性克隆命名為pQE80LfurB. 在含有氨芐青霉素（100 mg/L）的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)pQE

14、80LfurB. 按10%的接種量進(jìn)行轉(zhuǎn)接，37℃搖菌3 h，加入異丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.5 mmoL/ L，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4~5 h. 取1.5 mL細(xì)菌培養(yǎng)物，8000 g離心30 s收集菌體，加入2×樣品緩沖液劇烈振蕩混勻，100℃, 5 min；8000 g離心5 min；取上清進(jìn)行 SDSPAGE電泳檢測(cè). </p><p>　　1.2.5表達(dá)產(chǎn)物鑒定將經(jīng)誘導(dǎo)的pQE8

15、0LfurB和E.coli DH5α分別制樣，進(jìn)行Western blot分析. </p><p>　　1.2.6表達(dá)蛋白的可溶性分析大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)菌，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，收集細(xì)菌，超聲破菌. 離心后將上清和沉淀分別制樣，進(jìn)行SDSPAGE分析. </p><p>　　1.2.7表達(dá)產(chǎn)物的純化根據(jù)Ni2+NTA試劑盒的說明書, 將融合蛋白與Ni2+NTA結(jié)合, 用不同pH值咪唑溶液進(jìn)行洗脫,

16、得到純化產(chǎn)物. </p><p><b>　　2結(jié)果 </b></p><p>　　2.1furB片段的擴(kuò)增及序列測(cè)定經(jīng)25個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增，可得與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度相等的片斷（Fig 1）. 將DNA回收后插入pGEMTEasy載體，經(jīng)測(cè)序證實(shí)所擴(kuò)增的furB序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄的furB序列完全一致. </p><p>　　2.2表達(dá)載體

17、的構(gòu)建pQE80L經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后與furB目的片斷進(jìn)行連接反應(yīng)后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α. 挑取的克隆子進(jìn)行酶切鑒定，切出約561 bp大小片段的為陽(yáng)性克隆子(Fig 2 )，命名為pQE80L furB. </p><p>　　2.3furB在pQE80L表達(dá)載體中的誘導(dǎo)表達(dá)將pQE80LfurB經(jīng)37℃活化過夜，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后做SDSPAGE分析，從電泳圖中可以看出在Mr為1

18、5.0×103處出現(xiàn)了一條表達(dá)帶，表達(dá)量約占菌體總蛋白的20% (Fig 3). </p><p>　　2.4目的蛋白的鑒定所構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達(dá)的FurB蛋白以帶有6個(gè)組氨酸的融合蛋白的形式出現(xiàn)，使用鼠抗 (His)6 mAb驗(yàn)證FurB蛋白的表達(dá). 結(jié)果顯示在Mr為15.0×103處有一顯色帶，而對(duì)照無(wú)相應(yīng)條帶 (Fig 4). </p><p>　　2.5表達(dá)蛋白的

19、可溶性分析將上清和沉淀分別所制樣品，進(jìn)行SDSPAGE分析表明表達(dá)產(chǎn)物主要在細(xì)菌裂解后的沉淀中，而上清中則很少(Fig 5). </p><p>　　2.6目的蛋白的純化純化的產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE分析可在Mr為15.0×103處得到一條清晰的條帶(Fig 6). </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　由于

20、BCG免疫效果極不穩(wěn)定［2］，缺乏對(duì)MTB致病機(jī)制的深刻了解，現(xiàn)在全球已處于結(jié)核病的緊急狀態(tài)［3］. 入侵機(jī)體的MTB和宿主的關(guān)系是動(dòng)態(tài)的，必須快速適應(yīng)不利并不斷變化的環(huán)境. 金屬離子的獲取對(duì)病原菌的復(fù)制增殖是必需的. 鐵是多種酶的輔因子，參與電子轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化還原反應(yīng)［4］，在MTB的生長(zhǎng)過程中發(fā)揮了重要作用. 限制鐵的利用可以延緩MTB的生長(zhǎng)，同時(shí)鐵的利用情況可作為反映幾種毒性因子表達(dá)水平的指標(biāo)［5］. 相反，鐵的無(wú)限制地?cái)z取會(huì)導(dǎo)致鐵中

21、毒和氧化應(yīng)激從而使細(xì)菌停止生長(zhǎng)［6］. 病原菌的金屬調(diào)控蛋白主要有四個(gè)不同的簇組成，分別為Fur(ferric uptake regulator), DtxR(diphtheria toxin repressor), MerR和ArsR. MTB基因組包含了兩個(gè)相似的鐵攝取基因furA和furB, furA位于katG上游［7］，并與katG其表達(dá)調(diào)控有關(guān), 而furB的功能還不清楚. 基因序列分析，MTB基因組中的furB比f(wàn)urA更

22、相似于大腸桿菌fur, 因此furB可能是細(xì)胞內(nèi)多種基因表達(dá)的一個(gè)調(diào)控因子. </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的pQE80L表達(dá)載體為4751 bp，起始碼下游接有6個(gè)組氨酸，雙鏈環(huán)狀，Amp抗性，多克隆位點(diǎn)有9個(gè)單一限制性酶切位點(diǎn). PCR產(chǎn)物共有561 bp,其中furB本身有393個(gè)堿基，在其終止碼的下游的168個(gè)堿基為非編碼序列. 因此，furB克隆入pQE80L載體中與6個(gè)組氨酸融合，可產(chǎn)生共137個(gè)

23、氨基酸的融合蛋白，Mr為15.0×103左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論值相符合. 融合蛋白有(His)6的表達(dá)，因此通過檢測(cè)組氨酸的表達(dá)，可間接證明furB表達(dá)，同時(shí)(His)6的表達(dá)為進(jìn)一步純化蛋白提供了親和位點(diǎn)，它可與Ni2+特異性結(jié)合，通過Ni2+NTA親和色譜柱可得到純化的目的蛋白. </p><p>　　我們成功地在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)MTB的鐵調(diào)控相關(guān)蛋白FurB, 并進(jìn)行了初步鑒定和純化,為進(jìn)一步研究

24、FurB的功能奠定了基礎(chǔ). </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ 范雄林，徐志凱，李元，等. 結(jié)核分枝桿菌Ag85B成熟蛋白基因免疫［J］. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001;22(14):1283-1287. </p><p>　　Fan XL, Xu ZK, Li Y, et al. Gene vacc

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