1、結核分枝桿菌的細胞壁是維持其生長和增殖的重要結構，主要由分枝菌酸、阿拉伯聚糖半乳聚糖和肽聚糖（mycolic acid-arabinogalactan-petidoglycan，mAGP）三部分組成，其中肽聚糖是細菌生長所必需的。青霉素結合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）參與肽聚糖的合成和維護，因此，鑒定結核分枝桿菌中的青霉素結合蛋白，有助于了解肽聚糖的代謝機理。 我們通過生物信息學的方法

2、和細菌之間的相似性預測結核分枝桿菌基因組中的Rv3627c基因的表達產(chǎn)物為可能的PBPs，其結構兩次跨膜，并且可能具有羧肽酶或內肽酶的活性，參與肽聚糖的重建和多肽鏈之間的交聯(lián)，有可能成為新的潛在的抗結核藥物作用靶點。為了分析結核分枝桿菌中基因Rv3627c的功能，我們設計此課題進行研究：首先克隆結核分枝桿菌的Rv3627c基因，然后分別在大腸桿菌BL21（DE3）、C41（DE3）和恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegma

3、tis，Sm）中表達重組蛋白，并設計酶促反應分析該蛋白質的功能。 目的：（1）通過PCR的方法從結核分枝桿菌H37Rv菌株的基因組DNA中擴增出Rv3627c基因；（2）分別構建pET29b-Rv3627c和pVV16-Rv3627c表達載體；（3）分別在大腸桿菌BL21（DE3）、C41（DE3）和恥垢分枝桿菌mc2155中表達Rv3627c蛋白；（4）分析Rv3627c蛋白是否具有羧肽酶活性。 結果： 1．R

4、v3627c基因的克隆 從結核分枝桿菌H37Rv菌株基因組數(shù)據(jù)庫（http：//genolist．pasteur．fr/TubercuList/）中獲得Rv3627c基因的核苷酸序列（1395 bp）。根據(jù)其核苷酸序列設計上下游PCR引物，并分別在其上游引物和下游引物的5’端引入了NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點。以H37Rv菌株基因組DNA為模板擴增出了Rv3627c基因。 將Rv3627c基因克隆到pMD18載體，并

5、對Rv3627c進行DNA序列測定。結果顯示所克隆的Rv3627c基因與H37Rv菌株基因組數(shù)據(jù)庫中Rv3627c基因的核苷酸序列完全一致，說明在本次實驗中通過PCR的方法獲得的Rv3627c基因為正確擴增的基因，無堿基突變。 2．pET29b-Rv3627c的構建及Rv3627c蛋白在大腸桿菌中的表達 用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD-Rv3627c，將Rv3627c基因克隆到表達載體pET29b。在pET29b-Rv

6、3627c中，Rv3627c蛋白的C端與質粒上的組氨酸標簽形成融合蛋白。 用pET29b-Rv3627c質粒轉化到大腸桿菌BL21（DE3），并加入IPTG誘導表達重組蛋白。用SDS-PAGE鑒定了誘導表達的Rv3627c蛋白。 用pET29b-Rv3627c質粒轉化到大腸桿菌C41（DE3）的感受態(tài)細胞，用0．1 mM IPTG在37℃誘導C41（DE3）/pET29b-Rv3627c細菌3小時。超聲破碎細菌后對上清和

7、沉淀組分進行SDS-PAGE分析，結果表明Rv3627c蛋白在大腸桿菌C41（DE3）中被誘導表達。通過組氨酸-Ni2+親和層析技術純化Rv3627c蛋白，對純化的Rv3627c蛋白進行定量（考馬斯亮藍法），第1洗脫組分中Rv3627c蛋白濃度為1．03 mg/ml，并通過SDS-PAGE鑒定純化的Rv3627c蛋白。 3．pVV16-Rv3627c表達載體的構建及Rv3627c蛋白在恥垢分枝桿菌mc2155中的表達 用

8、NdeⅠ和HindⅢ雙酶切pMD-Rv3627c，將Rv3627c基因克隆到表達載體pVV16。用pVV16-Rv3627c表達載體電轉化mc2155感受態(tài)細胞。挑選6個單菌落接種到5 ml含Kan（25mg/ml）和Tween80（終濃度0．05%）的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃振蕩培養(yǎng)72小時，然后大體積培養(yǎng)mc2155p/VV16-Rv3627c細菌。收集、超聲破碎細菌，對上清和沉淀組分進行了SDS-PAGE分析，但無預期的蛋白條帶

9、。 4．Rv3627c蛋白的酶活性分析 提取mc2155p/VV16-Rv3627c及野生型mc2155細胞壁中的胞壁肽作為底物，設計了酶促反應。利用紙層析方法檢測反應生成的產(chǎn)物。通過結果推斷結核分枝桿菌Rv3627c基因表達的蛋白質可能具有羧肽酶活性。 結論：在本次研究中，我們分別構建了pET29b-Rv3627c和pVV16-Rv3627c表達載體，并分別在大腸桿菌BL21（DE3）和C41（DE3）表達了R