1、結(jié)核病是最嚴(yán)重的傳染性疾病之一,每年大約殺死2百萬人,世界上1/3的人口是潛伏感染者。由于人口流動速度的增加導(dǎo)致結(jié)核病與AIDS共感染,不規(guī)范不合理地濫用抗生素導(dǎo)致多重耐藥結(jié)核菌和廣泛耐藥結(jié)核菌的流行,使得近年來結(jié)核病預(yù)防工作遇到了瓶頸。2011年報道僅在歐洲就有15個多重耐藥性的國家,致使歐洲結(jié)核病“卷土重來”,尤其是英國倫敦,每年新增病例中2%是多重耐藥性結(jié)核病。目前臨床上主要使用一線抗結(jié)核藥物(異煙肼(Isoniazid)、利福平

2、(Rifampicin)、乙胺丁醇(Ethambutol)和鏈霉素(straptomycin))治療,但是隨著醫(yī)患工作中存在的問題如各種抗生素濫用,治療時間漫長,物質(zhì)和精神的雙重折磨,導(dǎo)致多重耐藥性和廣泛耐藥性結(jié)核病的出現(xiàn),且所占比例不斷地上升,引起了全球公共衛(wèi)生治療的高度重視。由于部分患者免疫系統(tǒng)受損,導(dǎo)致接種BCG的不安全,全球都在呼吁新型抗結(jié)核病藥物和治療性疫苗[1]。世衛(wèi)組織決定在2015年前使結(jié)核病死亡人數(shù)和流行率減半,要想達(dá)

3、到這個目標(biāo),除了需要政府強(qiáng)制性加強(qiáng)防范意識外,還亟需科研工作者更深入地了解結(jié)核分枝桿菌治病的機(jī)理。
　　 結(jié)核分枝桿菌面對復(fù)雜多變的環(huán)境,需要通過各種途徑來抵抗外界壓力,保持自身的平衡,其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子起著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)在特定環(huán)境下,如饑餓、氧化壓力等,IclR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對維持細(xì)菌生存起關(guān)鍵作用。IclR家族廣泛地分布于各種細(xì)菌中,參與多種生物學(xué)功能,如初級和次級代謝、毒性、群體感應(yīng)和芽孢。例如C.glutamicu

4、mIB1486突變體中亮氨酸和色氨酸的合成量都有增加[2],在PseudomonasputidattgV突變體中,外排泵ttgGHI操作子高表達(dá)[3],在Agrobacteriumtumefaciens中AttJ控制群體感應(yīng)信號的開關(guān)[4]。在E.coli中,IclR通過Icl(isocitratelyase)控制碳源的利用。Icl是乙醛酸支路中的關(guān)鍵酶,實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它通過提高細(xì)菌在巨噬細(xì)胞的存活來維持持續(xù)性感染,并且由于哺乳動物缺乏乙醛酸

5、循環(huán)途徑,所以Icl可作為潛在的藥物靶標(biāo)[5]。MycobacteriumtuberculosisCDC1551中兩個icl基因同時缺失,將導(dǎo)致胞內(nèi)細(xì)菌復(fù)制減退且迅速從肺組織中清除?；瘜W(xué)抑制劑3-nitropropionate(3-NP)抑制Icl1(aceA-1)和Icl2(aceA-2)活性,阻斷了以脂肪酸作為碳源的培養(yǎng)基和巨噬細(xì)胞中結(jié)核分枝桿菌的生長[6]。
　　 潛伏期的結(jié)核分枝桿菌是導(dǎo)致結(jié)核病化療療程偏長,療效不佳和化

6、療后再次復(fù)發(fā)的主要因素,也是結(jié)核病控制形勢比較嚴(yán)峻的原因之一。結(jié)核分枝桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后進(jìn)入持留狀態(tài),在此環(huán)境下可能極度缺乏葡萄糖和氨基酸等必要營養(yǎng)源,加之各種各樣的抗菌物質(zhì)和低pH環(huán)境等不利因素使結(jié)核菌的生存面臨極大危機(jī)。此時結(jié)核分枝桿菌可利用脂肪酸作為唯一營養(yǎng)源,通過乙醛酸循環(huán)途徑維持生存。M.tuberculosisH37Rv基因組中預(yù)測有三個IclR編碼基因,分別為Rv2989,Rv1773c,Rvl719,它們的氨基酸相似性

7、為14.7%,核苷酸相似性為26.3%,其中Rvl773c編碼序列在Mycobacteriumbovis中有一段完全相同的編碼序列。通過Tn5370轉(zhuǎn)座子誘變的H37Rv菌株發(fā)現(xiàn)Rv1773c可能參與結(jié)核分枝桿菌的毒性調(diào)控,Rv1773c突變體比野生型菌株對嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠毒性更強(qiáng),這可能解釋為Rv1773c突變,Icl活性增強(qiáng),使結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)更好地利用乙醛酸循環(huán)來維持生存[7]。因此探索結(jié)核分枝桿菌中IclR

8、與Icl的關(guān)系,是否也存在類似精確的乙醛酸循環(huán),具體調(diào)控機(jī)制如何,必然有助于認(rèn)識結(jié)核分枝桿菌潛伏期躲避傷害,維持生存的機(jī)制。我們期望利用對其他致病菌中IclR家族成員的研究來分析結(jié)核分枝桿菌中IclR家族的功能,以更好地闡明結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制,尋找治療結(jié)核病提供新的方法。
　　 為了研究結(jié)核分枝桿菌中Rv2989的基本功能,本文主要通過將MTBH37Rv的IclR家族成員Rv2989基因克隆到恥垢分枝桿菌中進(jìn)行表達(dá),研究其對

9、宿主菌生長、抗氧化壓力、生物膜形成以及亮氨酸合成等影響。從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得M.TuberculosisH37RvRv2989的核苷酸序列,利用PrimerPremier設(shè)計引物,提取MTBH37Rv基因組作為模板,體外擴(kuò)增獲得Rv2989基因。將Rv2989基因的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-TSimpleVector,然后亞克隆至穿梭性質(zhì)粒pNIT-myc中,經(jīng)質(zhì)粒抽提、菌落PCR驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證以及序列測序比對證明重組質(zhì)粒p

10、NIT-myc-Rv2989構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到恥垢分枝桿菌,通過菌落PCR驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證、16SRNA驗(yàn)證以及測序表明pNIT-myc-Rv2989成功電轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌中,利用western-blot驗(yàn)證己內(nèi)酰胺誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。為了進(jìn)一步了解Rv2989蛋白在生物體內(nèi)的功能,我們研究了過表達(dá)Rv2989蛋白對宿主菌的影響,包括宿主菌生長、抗氧化壓力和生物膜形成和亮氨酸合成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Rv2989過表達(dá)減緩宿主菌進(jìn)入穩(wěn)定期

11、的速率:當(dāng)過氧化氫濃度低時,Rv2989過表達(dá)增加抗氧化氫能力,但重組菌對生物膜形成和滑動能力沒有明顯的影響;Rv2989過表達(dá)誘導(dǎo)leuC表達(dá)。
　　 隨著結(jié)核分枝桿菌全基因組序列測定完成,科研工作者越來越關(guān)注這些大量未知基因的功能。為了更好地模擬體內(nèi)的生長環(huán)境,受酵母雙雜交系統(tǒng)的啟發(fā),AmitSingh等人利用分枝桿菌蛋白質(zhì)相互作用(M-PFC)系統(tǒng).來探索分枝桿菌中蛋白質(zhì)間的相互作用[8]。M-PFC系統(tǒng)主要原理是甲氧芐啶

12、是二氫葉酸還原酶的特異性抑制劑,但是該抗生素對細(xì)菌二氫葉酸還原酶的親和性是哺乳動物二氫葉酸還原酶的約12000倍,即一定濃度的甲氧芐啶能抑制細(xì)菌二氫葉酸還原酶活性,但不會影響哺乳動物二氫葉酸還原酶活性。本文參照M-PFC實(shí)驗(yàn)方案,通過尋找與Rv2989相互作用的蛋白,構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),探索Rv2989的功能機(jī)制。我們通過PCR擴(kuò)增出Rv2989基因片段,將Rv2989PCR產(chǎn)物連接到整合性質(zhì)粒pUAB400質(zhì)粒上,成功構(gòu)建pUAB400-Rv2

13、989重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到恥垢分枝桿菌中。利用pUAB300質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌H37RV基因組文庫,并提取質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到pUAB400-Rv2989重組恥垢分枝桿菌。通過pUAB400和pUAB300上所攜帶的蛋白質(zhì)相互作用賦予細(xì)菌完整的哺乳動物二氫葉酸還原酶活性,以抵抗甲氧芐啶,篩選出與Rv2989相互作用的蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該系統(tǒng)能在本實(shí)驗(yàn)室成功地應(yīng)用,但暫時并沒有找到與Rv2989相互作用的蛋白。對該結(jié)果分析可能是由于以下幾個原因,1