1、結(jié)核分枝桿菌在巨噬細胞中生存需要面對多種極端的環(huán)境，如缺氧、一氧化氮殺傷、營養(yǎng)缺乏等等。雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)對于結(jié)核分桿菌在這些極端環(huán)境中存活至關重要。目前對于雙組份調(diào)控系統(tǒng)孤兒反應調(diào)節(jié)因子Rv0818的功能及上游信號研究較少。本實驗利用溫敏性噬菌體介導的結(jié)核分枝桿菌敲除方法構(gòu)建了Rv0818單基因缺失株。通過比較缺失株與野生株在固體平板上形態(tài)學特征、對于一氧化氮的耐受以及在巨噬細胞中的存活情況，觀察Rv0818缺失對結(jié)核分枝桿菌的影響。并通

2、過檢測Rv0818下游基因表達量變化，驗證了Rv0818作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用。本實驗為結(jié)核病致病機理的研究提供了實驗基礎，同時給結(jié)核疫苗的研制提供了備選的基因缺失菌株。
　　1.結(jié)核分枝桿菌基因缺失株的構(gòu)建與鑒定
　　實驗成功將Rv0818同源重組區(qū)域插入到分枝桿菌噬菌體中，并利用噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌得到了能在Hyg抗性平板上生長的陽性克隆子。通過PCR鑒定和測序鑒定確定了目的基因被抗性區(qū)域替換，成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌基

3、因缺失株。
　　2.形態(tài)學特性比較
　　實驗比較了野生株與突變株在固體平板上的形態(tài)學特征。結(jié)果顯示缺失株在固體平板上生長形成更少的索狀結(jié)構(gòu)，而索狀結(jié)構(gòu)的形成與菌株的個體大小、生長速率以及細胞壁外層結(jié)構(gòu)密切相關，預示著Rv0818缺失株毒力的減弱。
　　3.NO耐受能力的比較
　　實驗比較了野生株和缺失株在NO刺激條件下的生長情況。結(jié)果顯示野生株與缺失株的生長會受到高濃度NO的抑制。而野生株能夠更快從NO抑制作用中

4、恢復，說明Rv0818的缺失影響了菌株對環(huán)境的適應能力。
　　4.胞內(nèi)存活能力的比較
　　實驗比較了巨噬細胞對野生株與突變株的吞噬率，結(jié)果顯示缺失株更容易被巨噬細胞吞噬。實驗還比較了菌株在感染細胞后24h、48h、72h的存活情況。結(jié)果顯示缺失株在胞內(nèi)活菌數(shù)基本不變，而野生株活菌數(shù)在感染72h時增加了3倍，說明Rv0818的缺失使菌株在胞內(nèi)的存活能力下降。
　　5.Rv0818下游基因表達量變化
　　實驗比較了R