1、結核分枝桿菌是全球主要的病原體之一，隨著多重耐藥菌株的增加，其威脅性也隨之增大。結核分枝桿菌的細胞壁相對較厚、硬并且具有疏水性，能夠有效地保護細菌，因此抗菌藥物的開發(fā)具有較高的難度。
　　 乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)，是一種一線抗結核的藥物。本課題利用生物信息學的方法，發(fā)現一種未知功能的基因Rv3717。當乙胺丁醇作用于結核分枝桿菌后，Rv3717基因的表達上調。該基因被預測具有水解肽聚糖的功能，可能會造成肽聚糖的

2、水解，引起細胞的自溶。
　　 肽聚糖是結核分枝桿菌細胞壁核心結構的重要組成部分，目前關于分枝桿菌細胞壁自溶素(也稱為肽聚糖水解酶)的了解并不多。已知枯草芽孢桿菌的cwlB基因是一種已知的細胞壁自溶素，把此基因的序列與結核分枝桿菌的基因組序列進行BLAST比對，找到兩種同源基因Rv3915和Rv3717，推測該兩種基因表達的蛋白質可能同樣具有肽聚糖水解酶的活性。有研究表明，Rv3915基因被成功克隆表達并且經鑒定具有肽聚糖水解酶的

3、活性。因此，Rv3717基因是否也有此活性是本課題所要解決的問題。
　　 對Rv3717基因肽聚糖水解酶活性的確定，有利于揭示EMB抗結核的作用機制，并為發(fā)現新的藥物靶點進而開發(fā)新一代抗結核藥物提供理論依據。
　　 目的：通過對Rv3717目的基因的克隆表達，純化目的蛋白，以對Rv3717基因的功能進行鑒定。
　　 方法：以結核分枝桿菌基因組DNA為模板，利用PCR技術進行目的基因的擴增。使用克隆載體pMD18-

4、T與目的基因以“A-T連接方式構建克隆質粒pMD18-Rv3717;被擴增的目的片段經測序正確后，載體和目的片段分別經雙酶切后進行連接，構建表達質粒。利用不同的載體和不同的宿主菌，通過調節(jié)誘導劑的濃度和誘導溫度等進行目的蛋白的優(yōu)化表達。利用SDS-PAGE和Western blotting檢測目的基因的表達，利用Ni2+親和層析柱對目的蛋白進行純化并用酶譜法對目的蛋白進行功能的檢測。
　　 結果：構建了克隆質粒pMD18-Rv3

5、717;擴增的目的基因經測序正確后，構建了無突變堿基的表達質粒pET29b-Rv3717和pET16b-Rv3717。表達質粒pET29b-Rv3717在所使用的各種宿主菌中的蛋白表達量極低。表達質粒pET16b-Rv3717在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達量高，但是絕大部分是以包涵體的形式存在，上清液中的可溶性目的蛋白比較少。目的蛋白的上清液經鎳柱純化以后，得到含有少量雜蛋白的目的蛋白的純化物。純化的目的蛋白沒有檢測到肽聚糖水解酶