1、帕金森病(Parinson′s disease，PD)是以黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元變性為特征的疾病，細胞移植是有前景的治療方法。尋找合適的供體細胞是PD細胞移植的關(guān)鍵問題之一。 虹膜色素上皮細胞(iris pigment epithelium,IPE)在解剖結(jié)構(gòu)上和睫狀體上皮細胞等相連，為單層上皮細胞，其下可見基底膜，可與基質(zhì)分離。近年來發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的IPE含有多種生長因子，如堿性成纖維細胞生長因子，膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子，腦源性神經(jīng)生長

2、因子，色素上皮生長因子等。這些生長因子對于保護神經(jīng)細胞、促進細胞的生長和發(fā)育有一定作用。雖然目前未見IPE細胞分泌多巴胺的報道，但是IPE細胞胞漿中含有黑色素顆粒，考慮到多巴胺和黑色素的產(chǎn)生有著共同的通路，所以我們檢測了體外培養(yǎng)的IPE細胞，我們發(fā)現(xiàn)IPE細胞可以分泌多巴胺和多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，并可以結(jié)合鐵離子，所以我們認為IPE細胞可以作為帕金森病移植治療的細胞來源。 免疫排斥是細胞移植的難題，海藻酸鈉—多聚賴氨酸是一種生物相容

3、性良好的半透膜材料，用它來包裹移植物可以很好起到免疫隔離的作用。 本實驗旨在：1．詳細研究豬IPE細胞體外多巴胺及神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌特性。觀察失去光線刺激的外環(huán)境是否會影響其功能，為其下一步的移植奠定基礎(chǔ)。2．將該細胞用海藻酸鈉—多聚賴氨酸包裹制作成微囊后，觀察微囊包裹對細胞活性和其分泌特性的影響。3．將微囊包裹后的IPE細胞立體定向植入PD大鼠模型的紋狀體，觀察移植后療效。 第一部分豬IPE細胞的體外原代培養(yǎng)及鑒定

4、 目的：建立穩(wěn)定的豬IPE細胞原代培養(yǎng)、純化及鑒定方法。 方法：酶消化法獲取豬IPE細胞，純化及傳代后，觀察細胞形態(tài)及生長狀況；繪制細胞生長曲線；免疫細胞化學方法鑒定細胞：細胞角蛋白(cytokeratin)和S—100的表達，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)，分別計算原代和傳代后陽性細胞率。結(jié)果：細胞胞漿內(nèi)含有大量黑色素顆粒；細胞經(jīng)純化、傳代后，cytokeratin和S—100表達陽性率均較原代提高，P<0.05；細胞生長曲線顯示：傳代后

5、第2～3天為指數(shù)生長期，3天以后為平臺期。 第二部分豬IPE細胞體外生物學特性研究 目的：觀察豬IPE細胞體外DA、神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌特性和鐵結(jié)合能力，以及失去光照的環(huán)境是否對IPE細胞功能產(chǎn)生影響。 方法：收集第1、2、3、4、5、6代IPE細胞傳代后48h的培養(yǎng)上清液，高效液相色譜-電化學法(HPLC)檢測樣品中的DA含量；第2代IPE細胞分為正常培養(yǎng)組、光照組和遮光組，收集各組傳代后第4，8，12，24，3

6、6，48，60，72h的培養(yǎng)上清液，HPLC 法測定DA 含量；ELISA法檢測BDNF、GDNF、NT-3和NGF的分泌量；并測定IPE細胞結(jié)合鐵的能力。免疫細胞化學法檢測IPE細胞中TH的表達；RT-PCR方法檢測該細胞中TH mRNA的表達。 結(jié)果：第2代IPE細胞在傳代后4h開始檢測到多巴胺的分泌，分泌量在48h達高峰，以后緩慢下降并趨穩(wěn)定；GDNF、BDNF、NT-3和 NGF的分泌以及鐵結(jié)合力較為恒定，隨著培養(yǎng)時間的

7、延長，并沒有明顯變化。傳代后各代IPE細胞DA分泌量無顯著區(qū)別；光照組的DA分泌在前16小時和其他兩組無差別，16小時后的DA分泌明顯高于其他兩組(P<0.05)。HVA、GDNF、BDNF、NGF和NT-13的分泌在各組之間沒有明顯差別(P>0.05)。遮光組的鐵結(jié)合力似乎低于其他兩組，但是沒有統(tǒng)計學意義。免疫細胞化學法檢測到IPE細胞中有TH的表達；RT-PCR方法檢測到IPE細胞內(nèi)有TH mRNA的表達。 第三部分海藻酸鈉

8、微囊的制作及微囊對IPE細胞生物活性的影響 目的：優(yōu)化適合IPE細胞的微囊制作條件。觀察微囊化對細胞分裂以及DA、神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌情況的影響。 方法：應用高壓靜電式微囊成型裝置制備海藻酸鈉-多聚賴氨酸微囊化細胞，摸索最適合的制備參數(shù)；顯微鏡下觀察微囊的形態(tài)，并測量微囊的直徑，用移植所用的針頭來回抽吸微囊觀察其強度；顯微鏡下觀察囊內(nèi)細胞的生長狀況，并在第0、3、6、9、12天破囊后進行細胞計數(shù)并用臺盼蘭染色法檢測囊內(nèi)細胞存

9、活率；將微囊化和非微囊化兩組細胞在接種后第1～6天收集培養(yǎng)上清液，檢測其中DA、HVA、BDNF、GDNF、NGF以及NT-3的量，觀察微囊包裹對其分泌特性的影響，并檢測鐵結(jié)合力。 結(jié)果：制備微囊的最佳參數(shù)為：室溫18～20℃，內(nèi)層海藻酸鈉濃度為2.4％，外層海藻酸鈉濃度為0.24％，液面高度為22～25mm，成囊電壓為3.28kv；微囊形態(tài)接近正圓，表面光滑，大小均一，直徑為：275±23gm。微囊經(jīng)針頭抽吸后未見破損；微囊內(nèi)

10、細胞的總數(shù)沒有明顯變化；細胞微囊化后培養(yǎng)60h內(nèi)，微囊組的DA分泌與非微囊組相比明顯增加；60h以后，二者無顯著差異。微囊內(nèi)細胞HVA、BDNF、GDNF、NGF、NT-3的分泌量與非微囊組細胞相比無顯著差異。鐵結(jié)合力二組之間沒有顯著性差別。 第四部分 PD大鼠模型的建立及IPE細胞的移植 目的：建立穩(wěn)定的6-OHDA毀損的偏側(cè)PD大鼠模型，確立可靠的行為學評價指標。觀察微囊化IPE細胞移植到模型大鼠紋狀體的療效。

11、 方法：1．模型的制備及鑒定：6-OHDA毀損內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle,MFB)建立PD大鼠模型，通過旋轉(zhuǎn)試驗、組織病理證實，并評價其它行為學指標是否有效。2．移植分組：分為IPE細胞+微囊組；空微囊組；單純手術(shù)損傷組，進行右側(cè)紋狀體兩點立體定向移植，分別植入2×10<'4>個IPE細胞、約280個含細胞的微囊，相應的對照組注射等量的生理鹽水和空微囊。3．移植后的檢測：觀察移植后大鼠旋轉(zhuǎn)行為以及其他行

12、為學指標的變化；HPLC法測定各組紋狀體區(qū)DA和HVA的含量。移植后第12周，取大鼠腦進行TH的免疫組化染色。提取移植區(qū)周圍組織的蛋白，電泳后觀察移植物是否影響移植區(qū)周圍腦組織的蛋白合成。 結(jié)果：1．大鼠模型經(jīng)旋轉(zhuǎn)試驗、組織病理鑒定模型成功。2．行為學指標：調(diào)整步態(tài)、啟動時間、單足運動的步距和速度是有效的行為學指標，自由運動的步距和速度不適合作為PD大鼠模型的行為學評價指標。3．移植后IPE+微囊組：33％的大鼠(10只)旋轉(zhuǎn)行

13、為在移植后第1周開始逐漸改善，至第4周改善更加明顯(與其他組相比，P<0.05)，幾乎不旋轉(zhuǎn)，一直持續(xù)到本試驗結(jié)束(第12周)。二次移植治療的大鼠從第二次治療的時間開始計算，仍有20％的大鼠(4只)有效。總的計算，有約47％的大鼠(14只)治療有效。這些出現(xiàn)療效的大鼠的調(diào)整步態(tài)、啟動時間、單足運動的步距和速度均明顯改善。其他兩組移植后行為學無明顯改善。各組移植后紋狀體 DA 含量的變化同其行為學改善相符合。4．組織免疫化學發(fā)現(xiàn)大部分微囊

14、形態(tài)不規(guī)則，囊壁皺縮，但囊壁完整、未見破損。微囊內(nèi)可見散在的圓形細胞。行為學得到改善的大鼠紋狀體TH染色顯示囊內(nèi)細胞呈陽性，微囊周邊的紋狀體可見TH陽性纖維密度較空微囊組和單純損傷組明顯增高。5．移植區(qū)周圍組織的蛋白和對側(cè)相比沒有明顯差別。6．IPE+微囊組中有1只大鼠移植后2周左右出現(xiàn)嚴重的扭轉(zhuǎn)痙攣，解剖后發(fā)現(xiàn)形成腫瘤樣組織。 結(jié)論 1．豬IPE細胞取材方便，易于分離、純化，體外生長、增殖活躍。機械-酶消化法獲得的細胞

15、經(jīng)免疫細胞化學鑒定證實為IPE細胞，傳代后細胞純度提高。 2．豬IPE細胞體外基礎(chǔ)狀態(tài)下即能分泌少量DA、GDNF、BDNF、NT-3和NGF，并具有結(jié)合鐵的能力。這些功能不受傳代的影響。光照會使DA分泌增加，其它功能不受影響。IPE細胞中還檢測到TH mRNA及蛋白的表達。 3．用高壓靜電微囊成型裝置制備的APA微囊形態(tài)、大小、均勻度及強度均十分理想。微囊內(nèi)的細胞不增殖。IPE細胞的 DA、GDNF、BDNF、NT-3