1、目的：脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)引起的內(nèi)毒素休克是一種常見的危重病理過程，死亡率可達50％～80％。血管功能紊亂、循環(huán)阻力降低及體循環(huán)血壓進行性降低是內(nèi)毒素休克的特征性病理變化之一。業(yè)已公認，血管內(nèi)皮細胞(vascularendothelialcell，VEC)不僅是機體血管的重要生物屏障，而且還具有內(nèi)分泌功能。在生理條件下，VEC的內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)產(chǎn)生適量一氧化氮(NO)參與調(diào)節(jié)血管緊張度和器

2、官血流量的分布；在內(nèi)毒素休克發(fā)病過程中，VEC的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達明顯上調(diào)、活性增高并產(chǎn)生大量的NO，導致VEC的激活和功能障礙，而VEC功能障礙在血管功能紊亂、循環(huán)衰竭的發(fā)生中至關(guān)重要。iNOS的表達調(diào)控主要在基因水平進行，VEC核因子κB(nuclearfactor-κB，NF-κB)在LPS誘生iNOS過程中起重要作用，NF-κB激活后能與iNOS基因啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)iNOS的轉(zhuǎn)錄和表達。因此，若能適度抑制VECN

3、F-κB的活性，有助于減輕由iNOS誘生NO所導致的VEC損傷，改善內(nèi)毒素休克血管功能紊亂。 八肽膽囊收縮素(cholecystokininoctapeptide，CCK-8)具有明確的抗休克作用。研究表明，CCK-8可使內(nèi)毒素休克和失血性休克大鼠的平均動脈壓(MAP)回升，提高其生存率；在離體條件下CCK-8可明顯減輕LPS誘導的VEC結(jié)構(gòu)損傷，改善內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)，而提高血管收縮反應(yīng)；CCK-8可顯著抑制LPS誘導的NF-

4、κB活性；CCK受體(cholecystokininreceptor,CCK-R)主要有兩種亞型即：CCK-AR及CCK-BR，CCK-8的抗休克作用可能由其受體介導。然而，有關(guān)CCK-8的抗內(nèi)毒素休克作用的機制尚未完全闡明，迄今為止，VEC是否存在CCK-R以及CCK-8對VECNF-κB的表達有無影響尚未見報道。本實驗以人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV-304為研究對象，觀察CCK-AR及CCK-BRmRNA在ECV-304中的表達，并初步

5、探討CCK-8對LPS誘導ECV-304NF-κB蛋白表達影響的受體機制。 方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV-304，傳代至對數(shù)生長期，調(diào)整細胞密度為每瓶1×107細胞，加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)液及不同處理因素檢測下列指標。 RT-PCR檢測CCK-AR及CCK-BRmRNA表達。實驗分為對照組、LPS量效組及LPS時效組。細胞分別用與實驗組等體積無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，0.01～10mg/LLPS作用

6、2h或1mg/LLPS分別作用0.5h，2h，6h和12h。用RT-PCR方法檢測ECV-304細胞CCK-AR及CCK-BRmRNA表達水平，并用Gel-pro凝膠分析軟件對RT-PCR結(jié)果進行半定量分析。 免疫細胞化學方法檢測NF-κBp65蛋白表達。先將細胞從培養(yǎng)瓶消化成細胞懸液并移至六孔板內(nèi)靜置24h。實驗分組如下：①對照組：加入與實驗組等體積無血清RPMI-1640培養(yǎng)液；②LPS組：細胞培養(yǎng)液中加入1mg/LLPS；

7、③CCK+LPS組：細胞培養(yǎng)液中先加入10-8mol/LCCK-8，10mm后加入1mg/LLPS；④CR-1409+CCK+LPS組：細胞培養(yǎng)液中先加入10-5mol/LCR-1409，30min后加入10-8mol/LCCK-8，10min后加入1mg/LLPS；⑤CR-2945+CCK+LPS組：細胞培養(yǎng)液中先加入10-5mol/LCR-2945，30min后加入10-8mol/LCCK-8，10min加入1mg/LLPS；⑥Pr

8、o+CCK+LPS組：細胞培養(yǎng)液中先加入2mg/L丙谷胺(Pro)，30min后加入10-8mol/LCCK-8，10min后加入1mg/LLPS。CR-1409、CR-2945分別是CCK-AR、CCK-BR的特異性拮抗劑，Pro是CCK-AR、CCK-BR的非選擇性拮抗劑。各組細胞于LPS刺激1h后終止各處理因素的作用，用免疫細胞化學方法檢測NF-κBp65的蛋白表達及細胞定位變化。用江蘇捷達801系列形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)對NF-κB

9、p65蛋白表達進行半定量分析，計算出每張玻片的平均灰度值。 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較，P＜0.05為有顯著性差異。 結(jié)果：1在ECV-304中存在著CCK-AR及CCK-BRmRNA表達，其中，CCK-ARmRNA擴增片段長度為320bp，CCK-BRmRNA擴增片段長度為332bp；測

10、序結(jié)果經(jīng)過Blast比對顯示，與Genebank中CCK-AR及CCK-BRmRNA序列完全吻合。 2LPS對ECV-304CCK-AR及CCK-BRmRNA表達的影響。(1)與對照組相比，0.01、0.1及1.0mg/LLPS孵育細胞2h可劑量依賴性引起CCK-AR及CCK-BRmRNA表達明顯升高(P＜0.05)，其中0.01mg/LLPS誘導CCK-ARmRNA效應(yīng)不明顯，而可明顯誘導CCK-BRmRNA表達；與1mg/L

11、LPS組相比，10mg/LLPS孵育細胞2hCCK-AR及CCK-BRmRNA表達未繼續(xù)出現(xiàn)明顯升高(P＞0.05)。(2)與對照組相比，1mg/LLPS孵育細胞0.5～2hCCK-AR及CCK-BRmRNA呈時間依賴性表達升高(P＜0.05)；與LPS孵育2h相比，1mg/LLPS孵育細胞6hCCK-AR及CCK-BRmRNA表達開始下降(P＜0.05)，但與對照組相比仍處于較高水平(P＜0.05)；與LPS孵育6h相比，1mg/LL

12、PS孵育細胞12hCCK-AR及CCK-BRmRNA表達進一步降低(P＜0.05)，與對照組相比已無明顯差異(P＞0.05)。 3CCK-8對LPS誘導ECV-304NF-κBp65蛋白表達的影響。溶劑對照組ECV-304中有少量NF-κBp65蛋白表達，主要分布于胞漿中，而胞核中較少；1mg/LLPS孵育ECV-3041h胞核中NF-κBp65蛋白表達明顯增加，與對照組相比有明顯差異(P＜0.01)；CCK-8與LPS共同作用

13、，胞核中NF-κBp65蛋白表達明顯降低，與LPS組相比有明顯差異(P＜0.01)；預(yù)先用CR-1409、CR-2945孵育細胞30min后再給予CCK-8和LPS處理，胞核中NF-κBp65蛋白表達與CCK+LPS組相比明顯升高(P＜0.05)，但仍低于LPS組(P＜0.05)，其中CR-2945的拮抗作用比CR-1409更明顯(P＜0.05)；Pro可完全翻轉(zhuǎn)CCK-8的抑制效應(yīng)。 結(jié)論：ECV-304存在著CCK-AR和C