1、本研究共分為兩部分，分別以HaCaT細(xì)胞和活體昆明無毛小鼠為UVB照射的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用Tempol為光保護(hù)劑，建立了Tempol抗UVB照射所致皮膚光老化的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；通過分析實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ透鞣N觀察指標(biāo)的變化，探討Tempol抗UVB照射所致光老化的作用機(jī)制，為防治光老化性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分 Tempol對(duì)中波紫外線照射所致HaCaT細(xì)胞光損傷防護(hù)作用機(jī)制的研究 目的: 1.建立UVB照射損傷

2、HaCaT細(xì)胞的光損傷模型，觀察Tempol對(duì)UVB照射所致HaCaT細(xì)胞光損傷防護(hù)作用的機(jī)制； 2.觀察Tempol對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響及其影響因素的研究： 3.觀察Tempol對(duì)LIVB照射后HaCaT細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響及其影響因素的研究； 4.觀察Tempol對(duì)UVB照射后HaCaT細(xì)胞FoxO3a mRNA表達(dá)的影響及其影響因素的研究。 方法: 1.HaCaT細(xì)胞的光

3、損傷模型的建立1.1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM置37℃CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 1.2紫外線光源UVB燈管，波長范圍290～320nm，峰值297 nm，40W，4只，4只燈管制成燈箱。 2.Tempol對(duì)光損傷防護(hù)作用實(shí)驗(yàn)2.1 HaCaT細(xì)胞分組將HaCaT細(xì)胞分為七組，分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F和G組。 A組：為正常對(duì)照組，不加入Tempol，不照射UVB； B

4、組：為UVB照射對(duì)照組，不加入Tempol，只照射UVB； C組：為含0.5mMTempol的實(shí)驗(yàn)組； D組：為含1mMTempol的實(shí)驗(yàn)組； E組：為含2mMTempol的實(shí)驗(yàn)組； F組：為含4mMTempol的實(shí)驗(yàn)組； G組：為含8mMTempol的實(shí)驗(yàn)組。 2.2細(xì)胞培養(yǎng)和照射劑量HaCaT細(xì)胞在培養(yǎng)板上生長到每孔匯合至80％以上時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出，無菌條件下加入Tempol。正

5、常對(duì)照組和照射對(duì)照組只加角質(zhì)形成細(xì)胞專用培養(yǎng)基以使各孔的終體積相等。細(xì)胞放入37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h后，除正常對(duì)照組外，其余六組均照射UVB，照射劑量為30mJ/cm2，光源與細(xì)胞的垂直照射距離為15cm。 2.3 HaCaT細(xì)胞增殖效應(yīng)的檢測(cè)HaCaT細(xì)胞經(jīng)UVB照射損傷并孵育18小時(shí)后，加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h，再加入二甲基亞砜，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔吸光值。 2.4 Ha

6、CaT細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)HaCaT 細(xì)胞經(jīng)LNB照射損傷并孵育18小時(shí)后，經(jīng)消化、離心，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入Annexin V-FTTC和PI溶液，流式細(xì)胞儀分析，測(cè)定HaCaT細(xì)胞的凋亡率。 2.5 HaCaT細(xì)胞FoxO3a mRNA表達(dá)的檢測(cè)HaCaT細(xì)胞經(jīng)UVB照射損傷并孵育18小時(shí)后，將所收集的細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)FoxO3amRNA的表達(dá)。 結(jié)論

7、 一定濃度范圍的Tempol(0.5mM，1mM，2mM，4mM，8mM)對(duì)UVB照射所致HaCaT細(xì)胞光損傷具有防護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與提高HaCaT細(xì)胞增殖效應(yīng)，抑制HaCaT細(xì)胞凋亡以及抑制HaCaT細(xì)胞Fox03a過度表達(dá)有關(guān)；其保護(hù)作用隨Tempol濃度的升高而降低，0.5mMTempol的防護(hù)作用最強(qiáng)。 第二部分 Tempol抗中波紫外線照射所致無毛鼠皮膚光老化的作用機(jī)制及其影響因素的探討

8、 目的: 1.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段照射UVB對(duì)皮膚外觀狀態(tài)變化的影響； 2.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段照射UVB對(duì)皮膚膠原纖維和彈力纖維結(jié)構(gòu)變化的影響； 3.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段照射UVB對(duì)皮膚超微結(jié)構(gòu)變化的影響； 4.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段照射UVB對(duì)皮膚丙二醛和羥脯氨酸含量變化的影響； 5.觀察無毛小鼠外用Tempol后不同時(shí)段

9、照射UVB對(duì)皮膚突變型p53蛋白表達(dá)的影響。 6.探討時(shí)間因素對(duì)Tempol抗光老化作用的影響。 方法: 1.光老化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明種無毛小白鼠72只，鼠齡6～8周，雌雄各半，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，體重20～25g，按同窩、同性別、同條件下飼養(yǎng)。 1.2 紫外線光源UVB燈管，波長范圍290～320nm，峰值297 nm，40W，4只。將4只燈管制成燈箱，照射高度為5

10、0cm。 2.Tempol抗光老化實(shí)驗(yàn)2.1動(dòng)物分組將72只昆明種無毛小鼠隨機(jī)分為六組，每組12只，分別標(biāo)記為A、B、C、D、E和F組。 A組：為正常對(duì)照組，外用三蒸水，不照射UVB； B組：為UVB照射對(duì)照組，外用三蒸水，照射UVB； C組：為外用0.36％Tempol 1h后照射UVB實(shí)驗(yàn)組； D組：為外用0.36％Tempol 2h后照射UVB實(shí)驗(yàn)組； E組：為外用0.36％Temp

11、ol 4h后照射UVB實(shí)驗(yàn)組； F組：為外用0.36％Tempol 8h后照射UVB實(shí)驗(yàn)組。 2.2 照射劑量除正常對(duì)照組外，其余五組均隔日照射UVB一次，照射劑量為0.111J/(cm2·次)，共14周，總劑量5.45J/cm2。 2.3 無毛小鼠皮膚外觀狀態(tài)變化的檢測(cè)選擇昆明無毛小鼠背部皮膚2x3cm2范圍，外用三蒸水或0.36％Tempol后，按上述分組情況進(jìn)行紫外線照射實(shí)驗(yàn)，隔周記錄皮膚外觀狀態(tài)并進(jìn)行評(píng)分

12、，共14周。 2.4 無毛小鼠皮膚膠原纖維和彈力纖維變化的檢測(cè)末次紫外線照射實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼法將各組動(dòng)物處死，用銳利刀片取其背部照射區(qū)面積0.5cm2大小的皮膚組織，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、HE及間苯二酚品紅法染色，在顯微鏡下觀察真皮內(nèi)膠原纖維和彈力纖維含量的變化及病理形態(tài)學(xué)改變。 2.5 無毛小鼠皮膚成纖維細(xì)胞和膠原纖維超微結(jié)構(gòu)變化的檢測(cè)在常規(guī)組織病理取材的同時(shí)，取背部0.1cm3的皮膚組織2～3塊，經(jīng)固定、脫水

13、、包埋、定位，制成50nm超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，HITACHI透射電子顯微鏡觀察成纖維細(xì)胞和膠原纖維超微結(jié)構(gòu)的變化。 2.6 無毛小鼠皮膚丙二醛(MDA)和羥脯氨酸(HYP)含量變化的檢測(cè)2.6.1 組織勻漿的制備和MDA含量的檢測(cè)在常規(guī)組織病理取材的同時(shí)，取各組無毛小鼠背部照射區(qū)皮膚，去除皮下脂肪稱重，制成10％組織勻漿；取0.1ml 10％組織勻漿，先后加入1、2、3號(hào)MDA測(cè)定試劑并混勻，95℃水浴中40mi

14、n，3500-4000r/min，離心10min，取上清液，分光光度計(jì)532am比色，計(jì)算MDA含量。 2.6.2 HYP含量的檢測(cè)在常規(guī)組織病理取材的同時(shí)，取各組無毛小鼠背部照射區(qū)皮膚，精確稱取皮膚(濕重)30-100mg放入試管，加入1ml水解液，加蓋后95℃或沸水浴水解20min，調(diào)PH值至6.0-6.8左右，加蒸餾水至10ml，取3ml稀釋的水解液加活性炭混勻， 3500r/min，離心10min，取上清液1ml先后加入

15、試劑1、2、3并混勻，60℃水浴中1.5min，冷卻后3500r/min，離心10min，取上清，分光光度計(jì)550nm比色，計(jì)算HYP含量。 2.7 無毛小鼠皮膚突變型p53蛋白表達(dá)的檢測(cè)在常規(guī)組織病理取材的同時(shí)，取各組無毛小鼠背部照射區(qū)皮膚，進(jìn)行突變型p53蛋白表達(dá)的免疫組化檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果經(jīng)美國Leiea DMI4000B圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖像的積分吸光度(A)分析。 結(jié)論: 外用0.36％的Tempol對(duì)UVB