1、目的：①研究二甲雙胍和胰島素或其類似物對人胰腺癌細(xì)胞miRNAs表達(dá)的影響。②體外實(shí)驗(yàn)研究明顯差異表達(dá)的miRNA對人胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響。③預(yù)測并驗(yàn)證明顯差異表達(dá)miRNA的靶基因。④動物實(shí)驗(yàn)研究二甲雙胍和胰島素或其類似物對胰腺癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響,及穩(wěn)定上調(diào)明顯差異表達(dá)的miRNA對裸鼠胰腺癌皮下移植瘤生長和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法：①采用Exiqon miRCURYTM LNA miRNA定

2、量PCR芯片檢測一定濃度二甲雙胍或甘精胰島素對人胰腺癌Sw1990細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響,并在不同的胰腺癌細(xì)胞、不同類型胰島素、不同藥物濃度和不同作用時(shí)間的條件下,采用Stem-loop定量PCR方法驗(yàn)證芯片結(jié)果。②選定差異表達(dá)最明顯的miRNA,采用siRNA干擾技術(shù)明顯上調(diào)或下調(diào)該miRNA,檢測其對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響:CCK8方法檢測細(xì)胞增殖;Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲、遷移;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。③根據(jù)多個(gè)

3、權(quán)威預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測該miRNA的靶基因,采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、定量PCR及Westemblot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。④構(gòu)建Sw1990細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型,檢測二甲雙胍和甘精胰島素對腫瘤生長影響;構(gòu)建該miRNA的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染Sw1990細(xì)胞后篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染該miRNA細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤和尾靜脈轉(zhuǎn)移瘤模型,檢測該miRNA在體內(nèi)對腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的影響。
　　結(jié)果：①miRNA定量PCR芯片結(jié)果表明二甲雙胍可上調(diào)

4、Sw1990細(xì)胞中9種miRNA的表達(dá)(≥2倍),miR-26a、miR-192和let-7c為上調(diào)最明顯的三個(gè)miRNA;甘精胰島素可上調(diào)Sw1990細(xì)胞中10個(gè)miRNA的表達(dá)(≥2倍),下調(diào)2個(gè)miRNA的表達(dá)(≥2倍),miR-95、miR-134和miR-34c-3p為調(diào)節(jié)最明顯的三個(gè)miRNA。Stem-loop定量PCR表明在Sw1990和Panc-1細(xì)胞中,二甲雙胍可以劑量依賴的形式上調(diào)miR-26a、miR-192和l

5、et-7c的表達(dá),但未見明顯的時(shí)間依賴關(guān)系;甘精胰島素和地特胰島素明顯上調(diào)了miR-95和miR-134的表達(dá),但對miR-34c-3p的表達(dá)無顯著影響,其中miR-134的表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系;普通胰島素和賴脯胰島素未明顯改變兩種胰腺癌細(xì)胞中miR-95、miR-134和miR-34c-3p的表達(dá)。②瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-26a可促進(jìn)Sw1990和Pane-1細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖、侵襲和遷移能力;轉(zhuǎn)染miRNA-26a抑制劑則可獲得相反的

6、效果。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-95可減少Sw1990和Panc-1細(xì)胞的凋亡,增強(qiáng)其增殖、侵襲和遷移能力;轉(zhuǎn)染miR-95抑制劑可獲得相反的效果。⑨雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、Western blot及定量PCR表明高遷移率族蛋白A1(HMGA1)為miR-26a的直接靶基因。④二甲雙胍可抑制Sw1990裸鼠皮下移植瘤的生長,而甘精胰島素對裸鼠皮下移植瘤的生長無顯著影響。采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-95的Sw1990細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤和尾靜脈轉(zhuǎn)

7、移模型,miR-26a可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,miR-95則可促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論：①二甲雙胍可顯著增高胰腺癌Sw1990和Panc-1細(xì)胞中miR-26a的表達(dá),而甘精胰島素和地特胰島素則顯著增高了Sw1990和Panc-1細(xì)胞中miR-95的表達(dá)。②體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明miR-26a可抑制胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移,而miR-95則可促進(jìn)胰腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移。胰腺癌細(xì)胞miRNA的相關(guān)變化可能是二甲雙胍、甘精胰島素和地特胰島