1、本研究首先對(duì)采自安徽不同地區(qū)的感染馬鈴薯Y病毒(PVY)的煙草和馬鈴薯病樣進(jìn)行病毒株系的分子鑒定。再利用dsRNA技術(shù),構(gòu)建HC-Pro基因部分片段反向重復(fù)載體轉(zhuǎn)化煙草,沉默外源侵染寄主的PVY沉默抑制子HC-Pro基因,在KNA水平上將HC-Pro基因的mRNA降解,使其不能表達(dá)發(fā)揮作用,從而提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗病毒RNA沉默效率。HC-Pro反向重復(fù)表達(dá)載體以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草,以獲得能夠穩(wěn)定遺傳的高抗或免疫PVY的轉(zhuǎn)基因煙草。

2、 1.來(lái)自安徽不同寄主PVY分離物的血清學(xué)鑒定及其CP基因分子進(jìn)化分析采集安徽不同地區(qū)感染馬鈴薯Y病毒(PVY)的煙草、馬鈴薯和番茄病樣,部分病樣的ELISA檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。RT-PCR克隆4號(hào)樣和7號(hào)樣PVY的CP基因并測(cè)序。結(jié)果表明,來(lái)自煙草PVY的CP基因(PVY-CP-4)和來(lái)自馬鈴薯PVY的CP基因(PVY-CP-7)序列全長(zhǎng)均為801 nts,編碼267個(gè)氨基酸。構(gòu)建PVY CP基因系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)及進(jìn)行序列相似性比較,PVY-

3、CP-4與PVYO、PVY N:O聚成一個(gè)分支,且與PVYO(EF026074)的序列相似性最高,達(dá)99.4％,說(shuō)明來(lái)源于安徽合肥煙草上的PVY應(yīng)該屬于PVYO株系；而PVY-CP-7與PVYN、PVYNTN聚成另一分支,且與PVYNTN (AJ890347)、PVYNTN (EF026075)和PVYNTN(AJ585342)的序列相似性最高,達(dá)98.3％,推測(cè)來(lái)源于安徽五河馬鈴薯上的PVY-CP-7可能屬于PVYNTN株系。

4、 2.侵染煙草的馬鈴薯Y病毒(PVY)HC-Pro基因的克隆及序列分析根據(jù)ELISA的檢測(cè)結(jié)果,選擇陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)烈的4號(hào)樣(煙草),RT-PCR克隆PVY HC-Pro基因并測(cè)序。結(jié)果表明,來(lái)自煙草PVY的HC-Pro基因(HC-Pro-4)全長(zhǎng)1359 bp,編碼453個(gè)氨基酸,與PVYN(AM268435) HC-Pro基因的核苷酸序列相似性最高,達(dá)99.0％。構(gòu)建PVY HC-Pro-4與其它14個(gè)PVY HC-Pro基因的系統(tǒng)關(guān)系

5、樹(shù),可以看出PVY HC-Pro-4與PVYN(AM268435)的親緣關(guān)系最近。HC-Pro基因的克隆為進(jìn)一步研究抗病毒基因工程奠定了基礎(chǔ)。 3.馬鈴薯Y病毒部分輔助成分蛋白基因的反向重復(fù)植物表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)PVY HC-Pro-4(AM905427)的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異性引物,分別克隆正反向ΔHC-Pro基因片段。先將反向片段ΔHC-Pro(i)插入含內(nèi)含子的載體pSK-In,獲得中間載體pSK-In-ΔHC-Pro(i)。

6、再將In-ΔHC-Pro(i)從pSK上切下,插入表達(dá)載體pBI121上,獲得重組質(zhì)柆pBI-In-ΔHC-Pro(i)。最后將正向片段ΔHC-Pro(r)插入pBI-In-ΔHC-Pro(i),得到含ΔHC-Pro反向重復(fù)的植物表達(dá)載體pBI-ΔHC-Pro(r)-In-ΔHC-Pro(i)。 4.反向重復(fù)表達(dá)載體以農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草利用三親交配法將反向重復(fù)表達(dá)載體pBI-ΔHC-Pro(r)-In-ΔHC-Pro(i)導(dǎo)入農(nóng)桿菌EH