1、第一部分阿司匹林對(duì)脂多糖誘導(dǎo)帕金森病模型多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　 目的：探討阿司匹林 (ASA)對(duì)脂多糖 (LPS)誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型中多巴胺能神經(jīng)元損傷是否具有保護(hù)作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：采用胚胎大鼠中腦原代細(xì)胞培養(yǎng)法，分別建立原代中腦神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)元-星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系。在原代中腦神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞中給予不同濃度ASA (0.01、0.1、和1m

2、mol/L)預(yù)處理1h后，給予脂多糖（10ng/ml），培養(yǎng)七天后，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目，western-blot 法檢測(cè)酪氨酸羥化酶(TH)在蛋白水平的表達(dá)；在原代中腦神經(jīng)元細(xì)胞，神經(jīng)元-星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞體系中ASA（1mmol/L）預(yù)處理1h后，LPS (10ng/ml)作用七天，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)空白對(duì)照組，ASA組，ASA+LPS組和LPS組中酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目。
　　

3、 結(jié)果：在LPS 誘導(dǎo)的中腦原代多巴胺能神經(jīng)元損傷中，LPS組中TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于ASA 預(yù)處理組和空白對(duì)照組，并且LPS組中TH 陽(yáng)性神經(jīng)元突起與其他組相比明顯減少甚至消失。ASA（0.01~1mmol/L）預(yù)處理能顯著改變這一變化，且呈劑量依賴(lài)性；在原代中腦神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)體系中，空白對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組中TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)并無(wú)顯著性差異；在原代神經(jīng)元-星型膠質(zhì)細(xì)胞系中，LPS組與對(duì)照組相比，TH 陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，但是LPS+AS

4、A組與LPS組相比較，TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異；在原代神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，與空白對(duì)照組相比，LPS 作用后可顯著減少TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并且ASA 預(yù)處理后可顯著減輕LPS 對(duì)多巴胺能神經(jīng)的損傷作用，提示ASA 對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用是通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的。
　　 結(jié)論：ASA 對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的中腦多巴胺能神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，并且此作用是由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的。
　　 第二部分阿司匹林對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)

5、胞模型中炎癥因子的調(diào)節(jié)作用
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)采用胚胎大鼠中腦原代神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系，應(yīng)用脂多糖建立多巴胺能神經(jīng)元損傷的炎癥機(jī)制模型，研究ASA 對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：在原代培養(yǎng)中腦神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞中，加入不同濃度ASA（0.01~1mmol/L）預(yù)處理1h后，給予LPS (10ng/ml)共培養(yǎng)七天后，檢測(cè)促炎癥因子，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）（ELISA kit），

6、一氧化氮（NO）(Griess 法)，超氧化物（WST-1 法），和胞內(nèi)活性氧（ROS）(DCFH-DA)；抗炎癥因子，包括IL-10（ELISAkit）和TGF-β1（ELISA kit）的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：0.01、0.1、1mmol/L ASA+LPS組中NO，TNF-α，超氧化物和胞內(nèi)ROS的濃度均較LPS組明顯降低；同時(shí)，0.01、0.1、1mmol/L ASA+LPS組中IL-10和TGF-β1的濃度與LPS組

7、相比較均有顯著增高。
　　 結(jié)論：ASA 能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中促炎癥因子表達(dá)和促進(jìn)抗炎癥因子生成，這可能是ASA 保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的機(jī)制之一。
　　 第三部分阿司匹林對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的帕金森病模型中NADPH 氧化酶的調(diào)節(jié)作用
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)主要研究阿司匹林對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型中NADPH 氧化酶的影響，進(jìn)一步探討其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。
　　 方法：采用胚胎大鼠中腦原代細(xì)胞培養(yǎng)法

8、，建立原代中腦神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系。ASA (1mmol/L)或NADPH 氧化酶抑制劑Apocynin（APO，0.25mmol/L）預(yù)處理1h后，給予LPS (10ng/ml)培養(yǎng)七天后，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)酪氨酸羥化酶陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目，western-blot 法檢測(cè)胞膜中P47phox在蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：TH 免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示LPS 作用后可顯著減少TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，ASA或APO 預(yù)處理后，能顯著增

9、加TH 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，ASA+LPS組，APO+LPS與LPS組相比較，均有顯著性差異。這一結(jié)果提示ASA和APO 都具有保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的作用，已知APO 能阻止NADPH 氧化酶胞漿亞單位（包括P47phox）與胞膜亞單位結(jié)合形成有活性的NADPH 氧化酶復(fù)合體，抑制NADPH 氧化酶活性。因此進(jìn)一步采用Western-blot 法檢測(cè)空白對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組中胞膜蛋白中P47phox表達(dá)變化，研究結(jié)果提示LPS 可增加P47phox在

10、胞膜的表達(dá)，ASA+LPS組，APO+LPS組與LPS組相比較，均顯著減少P47phox在胞膜中的表達(dá)水平，從而抑制了NADPH 氧化酶的活性。
　　 結(jié)論：阿司匹林能顯著抑制NADPH 氧化酶胞漿亞單位P47phox在胞膜中的表達(dá)，從而抑制了NADPH 氧化酶的活性。研究率先表明在脂多糖誘導(dǎo)的原代中腦混合細(xì)胞PD模型中，阿司匹林可以通過(guò)抑制NADPH 氧化酶活性，對(duì)抗過(guò)度炎癥反應(yīng)的毒性作用，從而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，這為探討阿司