1、干擾素-λs（Interferon-λ，IFN-λs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型干擾素，在氨基酸組成和功能方面與Ⅰ型IFN接近。IFN-λs的受體隸屬于Ⅱ型細胞因子受體家族(ClassⅡcytokinereceptorfamily,CRF2)，由特有的配基結(jié)合亞基IFN-λR1和輔助亞基IL-10R2組成。盡管IFN-λS與Ⅰ型IFN(IFN-α/β)使用完全不同的受體，但是均可通過激活JAK-STAT通路傳遞配基結(jié)合信號，因此IFN-λs

2、顯示出了與Ⅰ型IFN相似的抗病毒，抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)活性。值得注意的是，與Ⅰ型IFN受體不同，IFN-λR1的表達具有組織特異性，在骨髓造血細胞及腦、脊髓中樞神經(jīng)細胞表達量很低。這一特點使IFN-λs可望成為一種新型的免疫生物制劑，與目前臨床上普遍應(yīng)用的IFN-α相比，在發(fā)揮生物活性的同時有效地減少發(fā)熱、抑郁及骨髓抑制等副作用。
　　 本組前期工作中，以串聯(lián)多拷貝的形式構(gòu)建IFN-λ1表達載體并分泌到胞外的形式用畢赤酵母成功的表達

3、了重組人IFN-λ1（recombinanthumanIFN-λ1，thIFN-λ1），并對其生物活性進行了初步的研究。前期研究表明，thIFN-λ1能夠誘導(dǎo)細胞中JAK-STAT信號通路中STAT蛋白的磷酸化，并對某些細胞的增殖有一定的抑制作用；但存在著重組蛋白thIFN-λ1表達產(chǎn)量、純化效率有待提高，靶細胞尚不完全明確等問題。本論文在此基礎(chǔ)上，在thIFN-λ1的表達純化流程的優(yōu)化，理化性質(zhì)的鑒定和抗腫瘤活性以及N糖基化位點突變后

4、的性質(zhì)的觀察等幾個方面做了進一步的研究。
　　 本論文的第一部分工作是利用BMMY培養(yǎng)基高效表達thIFN-λ1，經(jīng)陽離子交換層析(SPSepharoseFastFlow，SPFF)及分子篩層析(Superdex75)兩步柱層析純化，獲得純度較高的thIFN-λ1。對純化步驟作了產(chǎn)率和純度分析后，又就重組蛋白的分子量、N端序列、等電點、肽質(zhì)量指紋圖譜及二硫鍵位置等理化性質(zhì)做了進一步鑒定。此外，本部分工作還研究了thIFN-λ1在

5、體內(nèi)外的抗腫瘤作用。以人結(jié)腸癌細胞HCT116和HT29兩株細胞為實驗對象。通過Real-TimePCR和WesternBlot分析了兩株細胞中IFN-λR1在mRNA和蛋白水平上的表達情況。通過MTT檢測thIFN-λ1抑制細胞增殖實驗，發(fā)現(xiàn)thIFN-λ1對兩種細胞的抑制作用呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。此外，thIFN-λ1還能引起兩株細胞中STAT的磷酸化并誘導(dǎo)兩株細胞的凋亡。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示thIFN-λ1的抑瘤率有明顯的劑量依賴效應(yīng)

6、，腫瘤抑制率分別達到52％(HCT116)和56%(HT29)，P值均小于0.01;之后我們對不同劑量組的腫瘤進行了Ki-67的免疫組化實驗，結(jié)果顯示隨著干擾素劑量的增加Ki-67指數(shù)呈明顯的下降趨勢。此外，我們還做了脾臟組織的HE染色和CD45R和CD3的免疫組化實驗，結(jié)果證明脾臟中的B細胞生發(fā)中心明顯增大，數(shù)量也明顯增多，但由于所用裸鼠為T細胞免疫缺陷，所以未發(fā)現(xiàn)CD3明顯變化。
　　 本論文的第二部分工作是利用重疊延伸PC

7、R定點突變技術(shù)將IFN-λ1蛋白質(zhì)序列中N-糖基化位點46位Asn（天冬酰胺）突變?yōu)榕c其具有相似結(jié)構(gòu)的Gln（谷氨酰胺），并構(gòu)建了6拷貝IFN-λ1-Nm(N46Q)表達載體，在轉(zhuǎn)化的畢赤酵母中分泌性表達了重組蛋白，并通過SPFF和Superdex75兩步層析，獲得了高純度的低糖化重組人IFN-λ1（IFN-λ1-Nm）。理化性質(zhì)的鑒定顯示thIFN-λ1的N-糖基化位點突變后對其理化性質(zhì)并無明顯影響。通過對細胞表面HLA-ABC表達的