1、干擾素(Interferon，IFN)是由動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的，具有抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等作用的一類細(xì)胞因子。IFN分為Ⅰ型、Ⅱ型和新發(fā)現(xiàn)的Ⅲ型，Ⅲ型干擾素又稱為IFN-λs，其氨基酸水平和蛋白質(zhì)功能與Ⅰ型相近。由于IFN-λs受體組織分布特異性，IFN-λs主要在呼吸道、消化道和皮膚黏膜組織以及上皮細(xì)胞或某些腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抗病毒作用，與IFN-α相比，能夠有效地降低毒副作用。在我國(guó)，奶牛病毒性傳染病如口蹄疫(FMD)、牛病毒性腹瀉病(BV

2、D)和牛傳染性鼻氣管炎(IBR)等可通過(guò)消化道、呼吸道傳播的疫病，至今危害仍比較嚴(yán)峻，因此牛IFN-λs成為繼IFN-α和IFN-β后，抗病毒制劑研發(fā)的一個(gè)方向。為深入研究牛IFN-λs的抗病毒活性及其機(jī)制，揭示其用于防治牛病毒病的可行性，本研究利用畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了無(wú)冗余氨基酸的重組牛IFN-λ3，同時(shí)酵母分泌表達(dá)了重組牛IFN-α和IFN-β，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組牛IFN-β和IFN-γ，深入研究了各重組干擾素的抗病毒

3、活性，比較了IFN-λ3與Ⅰ型和Ⅱ型干擾素單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用抗病毒活性的異同，主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1.首先在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了無(wú)冗余氨基酸重組牛IFN-λ3的可溶性表達(dá)。參考酵母密碼子使用偏好性，同時(shí)考慮自由能和二級(jí)結(jié)構(gòu)等要素，將已知的牛IFN-λ3（boIFN-λ3）基因序列優(yōu)化成適合酵母表達(dá)的最優(yōu)序列，然后利用重疊延伸PCR技術(shù)將設(shè)計(jì)的相互重疊20bp左右的14條寡核苷酸融合，獲得boIFN-λ3基因和及其等位基因命名

4、為boIFN-λ3*(1個(gè)基因差異使得成熟肽第18位氨基酸不同)。通過(guò)酶切連接的方式，成功構(gòu)建酵母分泌表達(dá)載體pPICZαA-boIFN-λ3和pPICZαA-boIFN-λ3*。在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中通過(guò)一系列的篩選鑒定，如陽(yáng)性重組酵母菌的鑒定，高表達(dá)酵母菌株的篩選，誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化等最終表達(dá)了重組boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白，表達(dá)量均可達(dá)1.2g/L，均以糖基化蛋白（23 kDa大小，占總蛋白70％左右）和非糖基化蛋白（

5、18 kDa大小，占總蛋白15％左右）2種形式表達(dá)。經(jīng)硫酸銨鹽析和陽(yáng)離子交換層析獲得了純化蛋白，重組蛋白均具有良好的抗原性，同時(shí)制備了抗boIFN-λ3*多抗。在MDBK-VSV系統(tǒng)測(cè)定重組boIFN-λ3和boIFN-λ3*蛋白的生物學(xué)效價(jià)分別為2.39±0.15×106U/mg/ml和2.15±0.40×106U/mg/ml。理化特性方面，重組蛋白均對(duì)胰酶敏感，對(duì)熱較為不敏感(63℃)，對(duì)酸堿部分敏感（pH2活性下降2倍），可被特異

6、性抗體中和。從重組蛋白的表達(dá)、純化、糖基化分析、理化特性、生物學(xué)活性和致細(xì)胞毒性等綜合分析，重組蛋白boIFN-λ3和boIFN-λ3*沒(méi)有區(qū)別。
　　 2.表達(dá)純化了重組牛IFN-α/IFN-β/IFN-γ并初步測(cè)定了它們的生物學(xué)活性。為比較重組boIFN-λ3與Ⅰ型和Ⅱ型IFN的抗病毒活性，酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組牛IFN-α和IFN-β，大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)純化了重組牛IFN-β和IFN-γ，測(cè)定它們的生物學(xué)活性分別為1.5

7、0±0.98×107、1.25±0.38×104、2.44±0.91×103和0.81±0.21×105 U/mg/ml。在MDBK-VSV系統(tǒng)中4種重組干擾素抗病毒效價(jià)大小排序?yàn)閎oIFN-α＞boIFN-λ3＞ boIFN-γ＞boIFN-β。在EBK和MDBK細(xì)胞上利用MTT法測(cè)定4種重組干擾素的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，重組boIFN-λ3和其他IFNs單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用致細(xì)胞毒性均較小。
　　 3.重組boIFN-λ3和boIF

8、N-α/boIFN-β/boIFN-γ誘導(dǎo)Mx1蛋白和ISRE啟動(dòng)子活性的研究。經(jīng)過(guò)Western blot檢測(cè)重組boIFN-λ3在4種上皮細(xì)胞源細(xì)胞（EBK、BT、MDBK和BMEC）中均能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生Mx1蛋白。采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，通過(guò)檢測(cè)ISRE報(bào)告基因的表達(dá)水平來(lái)間接反映干擾素的生物活性。結(jié)果顯示不同濃度的重組IFNs誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)均呈一定程度的劑量依賴性，重組boIFN-λ3和boIFN-γ誘導(dǎo)報(bào)告基因的表達(dá)水平呈時(shí)間

9、依賴性，48h達(dá)到較高水平;而boIFN-α和boIFN-β能夠快速的誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)，干擾素作用12h即達(dá)到較高的水平，且維持到48h。聯(lián)合應(yīng)用時(shí)部分組合比單獨(dú)應(yīng)用時(shí)誘導(dǎo)ISRE活性高。因此各IFNs刺激產(chǎn)生的ISRE啟動(dòng)子活性的差異可能是重組boIFN-λ3與其他IFNs協(xié)同抗病毒活性的機(jī)理之一。
　　 4.比較研究了重組boIFN-λ3和重組boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ抗IBRV、FMDV和BVDV的研究

10、。通過(guò)TCID50法測(cè)定抗IBRV和FMDV活性，抗cpBVDV采用噬斑減數(shù)法，抗ncpBVDV采用半定量RT-PCR法。結(jié)果顯示重組boIFN-λ3和其他3種重組IFNs均具有抗IBRV和FMDV的活性，且呈一定程度的劑量和時(shí)間依賴性。其中抗FMDV活性較強(qiáng)，抗IBRV活性較弱。重組boIFN-λ3可條件性的抑制cpBVDV和ncpBVDV的增殖，即在先孵育干擾素后感染病毒時(shí)，重組boIFN-λ3可抑制BVDV增殖，反之則沒(méi)有作用。<

11、br>　　 5.重組boIFN-λ3和boIFN-α/boIFN-β/boIFN-γ協(xié)同抗病毒的研究。通過(guò)測(cè)定干擾素作用后的病毒-細(xì)胞混懸液的TCID50，結(jié)果顯示重組boIFN-λ3抗IBRV時(shí)和boIFN-γ協(xié)同作用強(qiáng)，抗FMDV時(shí)，boIFN-λ3在EBK和BT細(xì)胞上均顯示出和boIFN-α/boIFN-β明顯的協(xié)同作用，提示在臨床應(yīng)用時(shí)可以聯(lián)合應(yīng)用重組boIFN-λ3和其他干擾素。推測(cè)協(xié)同機(jī)制可能與ISRE啟動(dòng)子活化水平及干擾

12、素刺激基因(ISGs)的表達(dá)等有關(guān)。
　　 6.ncpBVDV持續(xù)性細(xì)胞感染是否影響重組boIFN-λ3抗病毒活性的研究。ncpBVDV(HLJ-11)感染MDBK細(xì)胞后在不同濃度重組boIFN-λ3和重組boIFN-α壓力篩選下傳代8次，通過(guò)半定量RT-PCR檢測(cè)BVDV核酸，結(jié)果顯示在干擾素壓力下，病毒可以耐受干擾素，造成細(xì)胞持續(xù)性感染，而此種狀態(tài)下的MDBK細(xì)胞仍能感染VSV，且不影響重組boIFN-λ3在此細(xì)胞上發(fā)揮抗V