1、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)屬嗜鹽菌,廣泛分布于海水、鹽湖及海產(chǎn)品中。在沿海地區(qū),經(jīng)常因食用污染副溶血弧菌而又未經(jīng)煮熟的海產(chǎn)品而引發(fā)的食物中毒事件,患者出現(xiàn)腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱,甚至脫水、昏迷等癥狀。耐熱直接溶血素(TDH)與耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素(TRH)被認(rèn)為是副溶血弧菌的主要毒力因子,與副溶血弧菌的致病性有關(guān)。本研究的目的是:(1)分析不同來(lái)源副溶血弧菌分離株主要毒力基因的分布特征:(2)

2、比較副溶血弧菌在不同培養(yǎng)條件下tdh基因的表達(dá)差異;(3)初步探明副溶血弧菌海產(chǎn)品分離株tdh基因鄰近區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征。
　　 為了調(diào)查浙江沿海地區(qū)海產(chǎn)品及其養(yǎng)殖環(huán)境中副溶血弧菌的分布,分別在舟山、象山、溫州三地采樣385份,包括海水、泥土和海產(chǎn)品,其中278份樣品中分離到副溶血弧菌,分離率達(dá)71.8％。其主要毒力基因檢測(cè)顯示,27株呈tdh基因陽(yáng)性,占9.7％,而trh與ureC基因的檢出率分別為22.3％與11.8％。27株t

3、dh陽(yáng)性的副溶血弧菌中,有25株能在兔血平板上表現(xiàn)明顯的β-溶血(神奈川現(xiàn)象)。具有尿素酶表型的副溶血弧菌均攜帶trh與尿素酶基因ureC。對(duì)27株副溶血弧菌的tdh基因進(jìn)行克隆測(cè)序和進(jìn)化樹分析,結(jié)果表明海產(chǎn)品相關(guān)分離株與臨床分離株呈現(xiàn)不同的兩個(gè)簇,而環(huán)境分離株與臨床分離株的trh基因核苷酸序列之間沒有明顯的差異。
　　 運(yùn)用熒光定量PCR方法比較不同來(lái)源以及不同應(yīng)激條件下副溶血弧菌tdh基因的表達(dá)差異。提取副溶血弧菌總RNA,

4、反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以pvuA作為內(nèi)標(biāo)基因,利用SYBR Greeen進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。pvuA和tdh基因的熒光定量PCR融解曲線分析表明,兩者均為特異性擴(kuò)增。雖然同類來(lái)源的不同菌株間tdh表達(dá)量存在顯著差異,但副溶血弧菌臨床分離株的tdh mRNA平均表達(dá)量顯著高于海產(chǎn)品分離株(57.2比13.8)。在pH4.0、0.5％和8％NaCl應(yīng)激條件下,臨床株ZJ2和海產(chǎn)品分離株FJ14A的tdh mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(3

5、％NaCI,pH7.4);另一海產(chǎn)品分離株KP34(屬流行血清型O3:K6)在高濃度NaCl(8％)條件下的表達(dá)量顯著提高,而低pH應(yīng)激時(shí)tdh mRNA的表達(dá)量顯著降低。
　　 運(yùn)用基因步移與LA-PCR方法,擴(kuò)增了海產(chǎn)品分離株FJ14A的tdh基因側(cè)翼的核苷酸序列,并與數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明:水產(chǎn)品分離株FJ14A基因組中的tdh基因與tdh3最為接近,分布在與副溶血弧菌臨床株所不同的毒力基因簇上。該菌株的tdh3

6、基因上下游均有類插入序列(ISVs)與轉(zhuǎn)座酶特征,且與trh-ure基因簇緊密相連,與trh基因間的距離僅為15kb,中間分散著類插入序列的基因片段。
　　 上述結(jié)果表明:(1)浙江沿海地區(qū)海產(chǎn)品和相關(guān)環(huán)境中副溶血弧菌的污染比較嚴(yán)重,但主要毒力基因的tdh的陽(yáng)性率僅為9.7％,低于臨床株的tdh陽(yáng)性率。(2)不同副溶血弧菌分離株的tdh mRNA表達(dá)差異顯著,臨床分離株的tdhmRNA表達(dá)量總體上高于海產(chǎn)品分離株,副溶血弧菌在不