1、圍產(chǎn)期胎兒炎癥反應(yīng)綜合征(Fetal Inflammatory Response Syndrome，F(xiàn)IRS)是造成早產(chǎn)和早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷的最常見原因，臨床與流行病學(xué)資料證實早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷是兒童腦癱的一個重要危險因素。由于早產(chǎn)兒腦自質(zhì)損傷將影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，所以腦損傷后神經(jīng)再生修復(fù)機制的研究將顯得尤為重要。cAMP反應(yīng)序列結(jié)合蛋白(CREB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)啟動子中具有環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元(CRE)的基因轉(zhuǎn)錄，在神經(jīng)元再生、

2、突觸形成及學(xué)習(xí)記憶等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用，是細胞內(nèi)多種信號通路的一種關(guān)鍵成分。雖然國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)發(fā)生，但是對宮內(nèi)炎癥仔鼠腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生的研究目前很少涉及，而且CREB信號通路是否參與腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生和認知損害修復(fù)的分子機制尚不明確。本研究通過建立宮內(nèi)炎癥后仔鼠腦白質(zhì)損傷模型，研究仔鼠生后不同時間點海馬神經(jīng)發(fā)生的規(guī)律；以及研究CREB信號通路是否參與腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生；而且通過PI3K抑制

3、劑LY294002和PDE4抑制劑Rolipram干預(yù)，探討CREB信號通路在宮內(nèi)炎癥仔鼠腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生中的作用和分子機制。從腦損傷自身修復(fù)角度進一步闡述CREB信號通路在神經(jīng)發(fā)生及認知功能改善中的作用和分子機制，為防治早產(chǎn)兒腦白質(zhì)損傷和兒童腦癱的康復(fù)提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　研究宮內(nèi)炎癥腦白質(zhì)損傷后仔鼠生后不同時間點海馬神經(jīng)發(fā)生的規(guī)律，明確CREB信號通路是否參與調(diào)節(jié)腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生，解釋CREB信

4、號通路在宮內(nèi)炎癥腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生中的作用和分子機制，闡明CREB信號通路在官內(nèi)炎癥腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生及認知功能改善中的重要意義。
　　方法：
　　1.動物模型：實驗動物分2組：①空白對照組：在各時間點和實驗組等數(shù)量配對，②官內(nèi)炎癥組：SD雌鼠孕15天于左右兩側(cè)宮頸內(nèi)各注射大腸桿菌稀釋液0.2mL，待其生產(chǎn)，制備宮內(nèi)炎癥后仔鼠腦白質(zhì)損傷模型。各組仔鼠在不同時間點腹腔注射BrdU，24h后行主動脈灌注固定后制備3、

5、7、14、28日齡腦組織石蠟標本，用免疫組織化學(xué)法檢測BrdU陽性的增殖細胞數(shù)目變化；7日齡腦組織采用免疫熒光雙標記(BrdU/Nestin)檢測海馬齒狀回神經(jīng)干細胞增殖情況；28日齡腦組織采用免疫熒光雙標記(BrdU/NeuN、BrdU/GFAP)檢測海馬齒狀回神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞分化情況。
　　2.Morris水迷宮法：水迷宮的水池直徑為100cm，高60cm，水深51cm，水溫(22±0.5)℃，站臺高度為50cm，站臺頂端

6、平面10cm×10cm，平臺沒于水面下1cm，水池周圍參照物保持不變。實驗包括：①適應(yīng)性訓(xùn)練：實驗前1d讓動物在無安全平臺的水中適應(yīng)性游泳2min；②定位航行試驗：實驗歷時5d，每日分上、下午系列，每個系列包括4次，操作者將大鼠面向池壁從不同象限入水，發(fā)現(xiàn)平臺后，讓其在平臺上站立30s，將大鼠從平臺上拿下來休息60s，再隨機由下一象限入水進行試驗，如果120s內(nèi)找不到平臺，則由操作者幫助其上平臺，潛伏期記為最高分120s。記錄大鼠找到平

7、臺的時間(逃避潛伏期)；③空間探索試驗：第6天，撤去平臺，取隨機一點投大鼠入水池中，記錄2min內(nèi)大鼠穿過平臺所在象限的時間。④探索實驗結(jié)束后，休息三天，即水迷宮的第10天，再對全部大鼠進行一次水迷宮測試，方法同定位航行試驗，測試其遠期記憶的保持能力。
　　3.CREB信號通路與神經(jīng)發(fā)生：官內(nèi)炎癥組和空白對照組動物在相應(yīng)時間點(3、7、14、21、28日齡)斷頭取腦，應(yīng)用RT-PCR及Western blot檢測海馬齒狀回p-Ak

8、t、Survivin、p-CREB、BDNF、TrkB mRNA和蛋白質(zhì)表達變化；應(yīng)用免疫組化在28日齡對p-Akt、p-CREB、BDNF進行定位染色，進一步明確CREB信號通路的主要基因p-Akt、p-CREB和BDNF在海馬齒狀回神經(jīng)細胞的表達情況。通過以上方法證明CREB信號通路參與宮內(nèi)炎癥腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生。
　　4.CREB信號通路干預(yù)：宮內(nèi)炎癥組和空白對照組動物側(cè)腦室微量注射PI3K阻滯劑LY294002阻斷P

9、I3K/Akt信號通路，同時應(yīng)用磷酸二酯酶(PDE4)抑制劑Rolipram，增加腦內(nèi)cAMP濃度從而激活CREB信號通路.兩組動物分別在28日齡進行Morris水迷宮實驗觀測仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變，并通過激光共聚焦顯微鏡研究相應(yīng)年齡點仔鼠海馬齒狀回神經(jīng)細胞增殖和分化的變化，以及通過Westernblot檢測CREB信號通路主要組分p-Akt、p-CREB及BDNF蛋白的表達變化，進一步闡述CREB信號通路參與腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生的分

10、子機制。
　　結(jié)果：
　　1.宮內(nèi)炎癥組子宮及胎盤內(nèi)血管充血、水腫，并見大量中性粒細胞浸潤；宮內(nèi)炎癥組仔鼠腦白質(zhì)出現(xiàn)彌漫性病理改變，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)稀疏、呈篩網(wǎng)狀，少數(shù)出現(xiàn)嚴重的凝固性壞死和囊狀病變。
　　2.定位航行實驗結(jié)果顯示官內(nèi)炎癥組仔鼠游泳軌跡雜亂無章，逃避潛伏期較空白對照組顯著延長(P<0.05)；經(jīng)過尋找隱藏平臺訓(xùn)練，兩組動物的逃避潛伏期均有所下降，第4天以后兩組動物的逃避潛伏期無顯著性差異(P>0.05)?？臻g

11、探索實驗結(jié)果顯示官內(nèi)炎癥組仔鼠的穿越平臺次數(shù)較空白對照組顯著減少(P<0.05)，而且宮內(nèi)炎癥組仔鼠的遠期記憶保持能力較空白對照組降低，逃避潛伏期較空白對照組顯著延長(P<0.05)。
　　3.宮內(nèi)炎癥組新生3，7，14日齡(P3，7，14)仔鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞數(shù)較同日齡對照組顯著增加(P<0.05)，28日齡(P28)仔鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞數(shù)與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。官內(nèi)炎癥組新生7日齡(P7)

12、仔鼠海馬齒狀回BrdU+/Nestin+細胞數(shù)較對照組顯著增加(P<0.01)。宮內(nèi)炎癥組新生28日齡(P28)仔鼠海馬齒狀回BrdU+/NeuN+、BrdU+/GFAP+細胞數(shù)與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。
　　4.宮內(nèi)炎癥組仔鼠海馬P-Akt mRNA和蛋白質(zhì)表達與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，于3，7，14日齡(P3，7，14)表達顯著升高(P<0.05)。官內(nèi)炎癥組仔鼠海馬p-CREB mRNA和蛋

13、白質(zhì)表達與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，于14，28日齡(P14，28)表達顯著升高(P<0.05)。官內(nèi)炎癥組仔鼠海馬BDNFmRNA和蛋白質(zhì)表達與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，于3，7日齡(P3，7)表達顯著升高(P<0.05).免疫組化顯示p-Akt、p-CREB、BDNF在海馬齒狀回有定位表達。
　　5.予LY294002阻斷PI3K/Akt信號通路發(fā)現(xiàn)LY294002組仔鼠逃避潛伏期較對照組顯著延長(

14、P<0.05)，經(jīng)過5天的尋找隱藏平臺訓(xùn)練，LY294002組的逃避潛伏期未見顯著下降，并在第10天表現(xiàn)了較差的記憶保持能力，兩組比較有顯著性差異(P<0.05)。LY294002組仔鼠海馬齒狀回BrdU+/Nestin+細胞數(shù)較對照組顯著減少(P<0.05)。LY294002組仔鼠海馬p-Akt、p-CREB和BDNF蛋白質(zhì)表達較對照組顯著降低(P<0.05)。應(yīng)用磷酸二酯酶(PDE4)抑制劑Rolipram激活CREB信號通路，發(fā)現(xiàn)

15、LY294002+Rolipram組仔鼠逃避潛伏期較LY294002+生理鹽水組顯著縮短(P<0.05)，經(jīng)過5天的尋找隱藏平臺訓(xùn)練，LY294002+Rolipram組仔鼠的逃避潛伏期顯著下降，并在第10天表現(xiàn)了良好的記憶保持能力，與LY294002+生理鹽水組比較有顯著性差異(P<0.05)，而與空白對照+生理鹽水組比較無顯著性差異(P>0.05).而且實驗發(fā)現(xiàn)LY294002+Rolipram組仔鼠海馬齒狀回BrdU+/Nesti

16、n+細胞數(shù)較LY294002+生理鹽水組顯著增加(P<0.05)。LY294002+Rolipram組仔鼠海馬p-Akt、P-CREB和BDNF蛋白質(zhì)表達較LY294002+生理鹽水組顯著增加(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.宮內(nèi)炎癥腦白質(zhì)損傷可以造成學(xué)習(xí)記憶和認知功能缺陷；宮內(nèi)炎癥組仔鼠海馬齒狀回BrdU+細胞數(shù)和BrdU+/Nestin+細胞數(shù)顯著增加，表明腦白質(zhì)損傷可以誘導(dǎo)海馬神經(jīng)發(fā)生；經(jīng)過5天尋找隱藏平臺訓(xùn)練，

17、宮內(nèi)炎癥組仔鼠的逃避潛伏期顯著下降，表明腦白質(zhì)損傷后機體存在自身修復(fù)機制，可以改善學(xué)習(xí)記憶和認知功能缺陷。
　　2.宮內(nèi)炎癥組仔鼠海馬p-Akt、p-CREB與BDNFmRNA和蛋白質(zhì)表達較對照組顯著性升高，而且發(fā)現(xiàn)p-Akt、p-CREB、BDNF在海馬齒狀回有定位表達情況，說明CREB信號通路參與調(diào)節(jié)宮內(nèi)炎癥腦白質(zhì)損傷后海馬神經(jīng)發(fā)生。
　　3.LY294002能減少海馬神經(jīng)發(fā)生、加重學(xué)習(xí)記憶和認知功能缺陷并降低p-Akt