1、目的： 脆性X綜合征(Fragile X Syndrome)是一種常見的遺傳性智力低下綜合征，其發(fā)病率僅次于Down's綜合征，呈X連鎖遺傳。男性發(fā)病率為1/4000，女性為1/6000-8000。大多數(shù)的脆性X綜合征男性患者，存在顯著的智力低下，IQ值在20～70之間，表現(xiàn)為學習障礙，重度智力低下及自閉癥樣行為。 脆性X綜合征發(fā)病的分子遺傳學基礎是脆性X綜合征智力低下基因1(Fragile X mental retar

2、dation gene1，F(xiàn)MR1基因)(CGG)n結(jié)構(gòu)的擴展突變。(CGG)n重復序列的長度具有多態(tài)性，并且可以遺傳，在遺傳過程中易發(fā)生突變。當n擴展達到200次以上時，這種突變類型為全突變，常伴CpG島異常甲基化，F(xiàn)MR1基因失活，導致FMRP缺失，引起脆性X綜合征。 脆性X綜合征發(fā)病率在遺傳性智力低下綜合征中排第二位，該病的產(chǎn)生給患者、家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔和精神負擔。因為目前尚未出現(xiàn)明確有效的治愈方法，所以防治本病

3、的關鍵在于降低其發(fā)病率，開展廣泛的篩查工作，對攜帶者及患者予以遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷，阻止患兒的出生。 目前美國醫(yī)學遺傳學協(xié)會已公布出進行FMR1分子診斷的適用人群；大多數(shù)國家則已對脆性X綜合征開始實行針對性篩查，即針對通過家族史分析而確定的高危孕婦進行篩查；而部分國家，如芬蘭、以色列，更是在孕婦中進行常規(guī)篩查。在各國對脆性X綜合征都已有了正規(guī)的程序化的篩查診斷時，我國至今還沒有任何針對脆性X綜合征篩查的產(chǎn)品的問世，也仍未曾進行過廣

4、泛的篩查診斷工作，在脆性X綜合征篩查診斷和防治方面遠遠落后于其他國家。 脆性X綜合征的篩查診斷難以普及、各國沒有統(tǒng)一的篩查診斷方案，緣于脆性X綜合征的臨床表現(xiàn)多樣，臨床診斷困難，必須依靠實驗室診斷，而現(xiàn)有的各種脆性X綜合征實驗室篩查技術(shù)又存在以下的問題：費用昂貴；費時；條件、技術(shù)要求高；適用范圍不廣等。 所以本實驗擬建立一個費用低廉；快速；操作簡便，技術(shù)要求低；可以涵蓋男性、女性受檢者，包括(CGG)n正常范圍、所有前突

5、變及部分全突變的脆性X綜合征PCR篩查方法。 方法： 本實驗包括2項主要內(nèi)容： 1、快速DNA重亞硫酸氫鹽修飾。常規(guī)方法是使用氫氧化鈉將DNA化學變性，加入重亞硫酸氫鹽等過夜修飾單鏈DNA，用氫氧化鈉使DNA脫磺化完成向尿嘧啶的轉(zhuǎn)化并用樹脂純化修飾后的DNA。本實驗將預先準備好的DNA修飾粉劑配制成新鮮的DNA修飾液與DNA混合后，采用溫度變性(99℃)取代以往方案中的化學變性過程，在5min熱變性后直接過夜修飾

6、，再用達安研發(fā)的試劑盒使DNA脫磺化并純化DNA。 2、脆性X綜合征PCR體系建立。以修飾后的DNA反義鏈為模板在(CGG)n兩側(cè)設計引物進行熱啟動PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和ABI3100測序儀片段分析檢測(CGG)n重復次數(shù)，并進一步克隆、測序驗證。 結(jié)果： 1、經(jīng)克隆測序驗證兩種方法對(CGG)n的修飾均可達到100％，但采用快速方法的得率更高，其PCR產(chǎn)物電泳條帶比常規(guī)方法更亮，該方法還縮短了時間，

7、避免樹脂純化時正壓排液的不便，更方便臨床實驗室的應用。 2、通過測試4個(CGG)n重復次數(shù)已知的前突變、全突變男性和女性細胞株DNA、2個正常范圍的男性和女性DNA，該優(yōu)化的PCR反應體系可以擴增出大片段的(CGG)n重復序列，涵蓋所有前突變及部分全突變序列。應用ABI3100測序儀片段分析可精確檢測部分(CGG)n重復次數(shù)，通過優(yōu)化PCR添加劑，避免重復序列常見的影子帶，令分子診斷得出最準確的結(jié)果。 結(jié)論：