1、研究顯示Zeste基因同源物增強子2(enhancer ofzeste homolog2，EZH2)是果蠅zeste基因增強子的人類同源物，屬于PcG(Polycomb group)蛋白家族，為表觀遺傳蛋白調控因子PcG的核心成分之一，具有組蛋白賴氨酸甲基轉移酶活性。眾多研究顯示EZH2在乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。我們的前期工作中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EZH2在膠質瘤中高表達，且與膠質瘤預后相關，提示EZH2在膠質瘤中是潛在

2、促癌分子，但其具體功能及相關機制有待闡明。代謝調控是人體生命活動的基本問題，其狀態(tài)異常與多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。“細胞能量異常（Deregulating Cellular Energetics）”是腫瘤細胞的特征之一。膠質瘤發(fā)生于神經(jīng)外胚層，來源于神經(jīng)膠質細胞，是具有高度異質性的原發(fā)顱內腫瘤，具有發(fā)病率高、復發(fā)率高、病死率高的特點。中樞神經(jīng)系統(tǒng)以葡萄糖為唯一能源，因此胞內能量代謝產(chǎn)物及代謝過程的變化尤其是糖代謝異常與膠質瘤的發(fā)生

3、發(fā)展關系密切，探索膠質瘤細胞糖代謝異常的分子機制對膠質瘤的診斷治療相關研究具有重要意義。本研究分為三個部分：
　　第一部分：借助中國膠質瘤協(xié)作組(CGGA)數(shù)據(jù)庫，分析PeG相關基因在膠質瘤組織和正常腦組織中的表達情況，并在獲得的結果基礎上逐步細化差異表達基因與膠質瘤組織級別的相關性，同時關注EZH2與患者生存預后的關系;隨后，分別使用RNA干擾手段和EZH2抑制劑DZNep下調膠質瘤細胞中的EZH2，通過細胞糖酵解水平檢測（EC

4、AR實驗）評價EZH2對膠質瘤細胞糖代謝功能的影響。結果顯示:EZH2下調后，膠質瘤細胞基礎糖酵解水平、最大糖酵解能力和糖酵解儲備量均明顯降低，說明EZH2在有氧糖酵解過程中發(fā)揮重要作用。β-catenin信號通路是腫瘤發(fā)生演進過程中的經(jīng)典通路之一，β-catenin已被報道與EZH2存在交互調控關系。為了驗證這種交互機制對上述糖代謝過程的影響，我們引入β-catenin的小分子抑制劑FH535處理膠質瘤細胞，發(fā)現(xiàn)β-catenin活性

5、抑制后膠質瘤細胞基礎糖酵解水平、最大糖酵解能力和糖酵解儲備量均明顯降低，說明β-catenin能夠影響膠質瘤代謝，這為EZH2的糖代謝調節(jié)功能提供了一個可能的效應出口。微小RNA（microRNAs，miRNA）近10年來始終是腫瘤研究領域的熱點。miRNA的信號傳遞體系包括多種形式，其本身接受上游轉錄調控分子信號，向下游則可通過識別特定的目標mRNA的3'端非編碼區(qū)域(3'-untranslated region，3'-UTR)，在轉

6、錄后水平通過促進靶mRNA的降解和/或抑制翻譯過程而發(fā)揮調控基因表達。隨著系統(tǒng)生物學研究的開展，miRNA的研究也從單一功能走向整體綜合的水平。大量報道證實miRNA表達譜特征與腫瘤的診斷、分期、進展、預后及治療效果存在相關性，是腫瘤基因調控網(wǎng)絡中的重要樞紐分子。作為轉錄抑制因子，EZH2可沉默下游諸多靶基因，而miRNA也是一大類可被EZH2調控的靶向分子。
　　第二部分：使用siRNA和DNZep兩種處理方法，分別借助miRN

7、A表達譜芯片技術篩選EZH2相關miRNA差異譜。結果顯示，膠質瘤細胞使用si-EZH2處理后有204種miRNA表達上調，59種下調，而使用DNZep處理后有206種miRNA上調，22種下調，取兩者交集為EZH2相關的靶miRNA譜，獲得以miR-328、miR-1224-3p和miR-214為代表的85種呈均一趨勢顯著上調的miRNA。結合生物信息學靶點預測，我們構建了β-catenin3'-UTR區(qū)潛在結合位點的熒光素酶報告基因

8、質粒，雙報告基因檢測驗證β-catenin確實為miR-328、miR-1224-3p和miR-214的直接靶基因，提示miR-328、miR-1224-3p和miR-214可介導EZH2對β-catenin的調控作用。之后，在CGGA數(shù)據(jù)庫同時進行mRNA芯片和miRNA芯片檢測的膠質瘤組織樣本數(shù)據(jù)中，我們分析發(fā)現(xiàn)EZH2與miR-328表達呈現(xiàn)顯著的負相關關系，而與miR-1224-3p和miR-214的關聯(lián)性并不顯著。因此，我們決

9、定選擇以miR-328為例進一步探索miRNA介導的EZH2作用機制。表觀遺傳學指在不改變DNA序列的前提下，通過某些機制引起可遺傳的基因表達或細胞表型變化。近年來研究者們逐漸意識到表觀遺傳變異對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和預后能夠產(chǎn)生重大影響，研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)異常等在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調控作用。目前在膠質瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可以導致細胞周期、凋亡、DNA損傷修復等過程的多種相關基因表達沉默。EZH2是多梳抑制復合

10、體2（Polycomb repressive complex，PRC2）的核心催化組分，可通過其高度保守的SET區(qū)域對核小體組蛋白H3K27進行甲基化。約50％的miRNA基因與CpG島有關，其可能被表觀遺傳甲基化抑制。
　　第三部分：應用亞硫酸鹽處理后測序法檢測miR-328啟動子區(qū)甲基化水平，結果顯示EZH2下調后miR-328啟動子區(qū)甲基化水平明顯受抑，隨后結合染色質免疫共沉淀實驗(CHIP)證實了EZH2與miR-328啟

11、動區(qū)的結合位點。最后，為了進一步驗證EZH2對膠質瘤細胞糖代謝的影響是通過miR-328介導所實現(xiàn)的，我們設計了相應的回復實驗。在對照組和si-EZH2轉染組基礎上增加si-EZH2+ si-miR-328組，將si-EZH2與si-miR-328共轉入細胞，EACR實驗顯示共轉組中ECAR比si-EZH2轉染組出現(xiàn)回復效應，且si-EZH2引起的β-catenin表達下降可被si-miR-328回復，說明si-miR-328可逆轉si