1、研究背景和目的： 結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的慢性傳染病。全世界有三分之一的人感染MTB，其中5％～10％的感染者發(fā)展成為活動性結核病，是否發(fā)病不僅與侵入機體的細菌數(shù)量和毒力等因素有關，還與機體的免疫功能有關。MTB為胞內寄生菌，故機體的抗結核免疫主要依靠T細胞為主的細胞免疫，T細胞通過TCR識別抗原，識別過程受主要組織相容性(抗原)復合物(major hist

2、ocompability complex，MHC)的限制。MTB感染機體后，抗原遞呈細胞(antigen present cells，APCs)對其進行加工處理，與APCs表面的人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)形成HLA／肽復合物，TCR特異性識別HLA/肽復合物，進而介導一系列的免疫反應。 因此，TCR與HLA／肽的特異性相互作用可用于抗原特異性T細胞的檢測。但是HLA／肽單體雖然能與T

3、CR結合，但親和力低，解離速度快，而不能直接用來檢測抗原特異性T細胞。Altman等于1996年創(chuàng)建了可溶性MHC／肽四聚體技術，將復合物單體四聚化，從而大大提高了MHC／肽復合物與TCR的親和力和穩(wěn)定性，使這一難題得到解決。 目前，MHC Class Ⅰ／肽四聚體已被廣泛用于分析CD8+T細胞在抗病毒、抗腫瘤和自身免疫病中的作用。傳統(tǒng)制備MHC Class Ⅰ／肽四聚體的方法是分別制備可生物素化的重鏈和β2m，然后二者再和特異

4、性抗原肽在體外一起折疊復性，形成MHC Class Ⅰ／肽復合物，形成的復合物單體與帶有4個親生物素亞基的鏈霉親和素以4:1比例混合構建成四聚體。相比Ⅰ類分子，MHC Ⅱ類分子(DR)是由α鏈和β鏈以非共價鍵形成的異二聚體，兩條鏈都具有多態(tài)性，體外折疊時往往不能很好的錨合短肽，其四聚體的制備要復雜得多。據(jù)Novak報道，在α、β鏈的C端連上亮氨酸拉鏈基序和連接蛋白，且β鏈上加上可生物素化的底物肽(BSP)，經大量表達、純化、生物素化后，

5、與多肽共孵育，形成MHC Class Ⅱ／肽復合物，再與藻紅蛋白(PE)標記的鏈霉親和素結合形成MHC Class Ⅱ／肽四聚體。用原核表達體系從大腸桿菌包涵體分離出的MHC Ⅱ類分子結構往往不穩(wěn)定，后來多采用桿狀病毒．昆蟲表達體系。MHC Ⅱ類分子必須完成生物素化才能與鏈霉親和素結合形成四聚體，體外生物素化需要購買昂貴的BirA酶，而且在純化和濃縮過程中會丟失20％～50％的蛋白。鑒于這些原因，研究者們又創(chuàng)建了與α、β鏈與BirA酶基

6、因共轉染的方法，從而使MHC Ⅱ／肽四聚體的制備過程更快捷經濟。本實驗的目的是擴增結核患者HLA Class Ⅱβ鏈(DRB)全長序列，對測序結果進行分析比對，構建能夠穩(wěn)定表達HLA DR／肽復合物的細胞株：一種表達于細胞膜上，以期用來分析和鑒定TCR四聚體α、β鏈的最佳組合和功能；另一種是分泌表達可生物素化的雙鏈單體、以用來制備HLA DR／肽四聚體，為探索和發(fā)展其作為結核診斷與研究用新方法和新型疫苗的可能性建立基礎。 研究內

7、容和方法：分離MTB多肽陽性反應的活動性結核患者胸水(PLF)和外周血(PBMC)標本中的淋巴細胞，提取其總RNA，利用Switch Mechanism At 5'-end of Reverse Transcript(SMART)逆轉錄獲得全長cDNA，并通過LD PCR合成互補鏈。根據(jù)GenBank已有HLA-DRB序列分別設計能擴增包括HLA Class Ⅱ DR β鏈先導序列起始密碼和終止密碼的上下游引物，經PCR擴增獲得完整的H

8、LA Class Ⅱ DR β鏈(DRB)編碼序列。PCR回收產物連接入pGEM-Teasy載體，藍白篩選得到陽性克隆，委托公司測序。測序結果利用DNAstar分析軟件及網(wǎng)上資源進行分析、比對，得到不同的等位基因。得到的等位基因一方面以全長的形式克隆入表達載體pMT／V5／His-A，與帶有MTB多肽的HLA Class Ⅱα鏈(DRA)全長表達載體共轉染果蠅S2細胞，蛋白分子表達于胞膜上；另一方面設計去除HLA Class Ⅱβ鏈跨膜

9、區(qū)和胞內區(qū)編碼基因，然后在C端連入編碼親水性氨基酸基因和生物素化酶底物基因，克隆入表達載體pMT／V5/His-B構建分泌表達重組載體，與α鏈分泌表達重組載體及BirA表達載體共轉染S2細胞后以生物素化的二聚體的形式分泌表達于胞外。 結果：本實驗分別從8位MTB多肽陽性反應的結核患者外周血或胸水標本中擴增出了完整的HLA Class Ⅱ DR β鏈(DRB)編碼序列，共得到26個陽性克隆，經過序列分析比對，最終獲得8種HLA D

10、RB等位基因克隆，其中各有2位患者存在相同的等位基因HLA DRB1*0818或DRB1*150101(見表1)。結合本課題組其他成員的結果分析HLA DRB1*0818等位基因的頻率(共17例，占總例數(shù)的40.5％)高于其他等位基因(見表2)。分別構建了8個全長序列pMT重組表達載體和8個pMT重組分泌表達載體，分別以此亞克隆重組載體與分別帶有不同MTB多肽的α鏈重組表達載體配對轉染果蠅S2細胞。可得到兩種形式的表達HLA DR／肽復

11、合物單體的細胞株：與4種帶有不同MTB多肽的α鏈全長表達載體配對轉染果蠅S2細胞，免疫細胞化學染色鑒定獲得9個細胞膜上表達HLA DR／肽復合物單體的穩(wěn)定細胞株；另一種是與2種帶有不同MTB多肽的α鏈分泌表達載體配對及BirA表達載體共轉染果蠅S2細胞，Dot Blotting鑒定獲得16個分泌表達生物素化的HLA DR／肽復合物單體的細胞株。 結論 1.采用SMART和LD-PCR的技術方法克服樣本量小的問題，利于對一

12、份樣本進行多個方面的研究。 2.序列分析顯示同一標本可得到不同的HLA-DRB等位基因，不同的標本也有相同的HLA-DRB等位基因；HLA DRB1*0818等位基因的頻率(共17例，占總例數(shù)的40.5％)高于其他等位基因，提示其與結核易感可能具有相關性。 3.獲得穩(wěn)定表達跨膜HLA DR／MTB肽復合物單體的恒定S2細胞株9株，可作為APC用于CD4+ TCR四聚體的α和β鏈最佳配對檢測和功能研究。 4.獲得穩(wěn)