1、鈣周期素結(jié)合蛋白(CacyBP)最初是由Filipek等人在小鼠艾氏腹水細胞瘤中發(fā)現(xiàn)的S100A6蛋白的靶分子,之后有學者在人細胞中發(fā)現(xiàn)一種與Siah-1結(jié)合的蛋白,稱為Siah-1結(jié)合蛋白,簡稱SIP。經(jīng)序列分析比較,CacyBP與SIP之間有93％同源性,提示SIP即為人CacyBP。CacyBP/SIP編碼229個氨基酸,其蛋白分子量約為30KDa。先前的研究發(fā)現(xiàn),CacyBP/SIP能夠與S100家族的部分蛋白呈Ca2+依賴性結(jié)

2、合。CacyBP/SIP在神經(jīng)組織中高表達,可能與神經(jīng)分化有關(guān)。CacyBP/SIP還可與Siah-1、Skp1結(jié)合形成泛素連接酶復(fù)合物,參與β-catenin的降解,進而影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最新的研究發(fā)現(xiàn),CacyBP/SIP還與阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展有著較密切的聯(lián)系。另外,研究發(fā)現(xiàn)CacyBP/SIP在神經(jīng)細胞中有Ca2+依賴的核轉(zhuǎn)位及磷酸化的現(xiàn)象。我們之前的實驗發(fā)現(xiàn),CacyBP/SIP在胃癌細胞中主要定位在胞漿,但是細胞內(nèi)C

3、a2+的升高和PKC的激活均能使CacyBP/SIP發(fā)生核周及核轉(zhuǎn)位,并且過表達CacyBP/SIP可以抑制腎癌及胃癌細胞的增殖。基因芯片顯示,CacyBP/SIP可以下調(diào)細胞中cyclinB3和cyclinA1水平,因此,我們推測CacyBP/SIP是細胞周期調(diào)控分子,可能通過蛋白降解或其他途徑影響細胞分裂周期,尤其是G2/M期。由于蛋白質(zhì)分子在細胞的亞定位與其本身的功能發(fā)揮有著緊密的聯(lián)系,所以本實驗旨在研究CacyBP/SIP在細胞

4、周期不同時期的亞細胞定位、蛋白表達、磷酸化水平的變化,并通過對CacyBP/SIP泛素連接酶復(fù)合物其他分子的定位及表達變化的觀察,進而研究各分子之間相互作用的情況,揭示CacyBP/SIP對細胞周期可能的調(diào)控作用,為深入闡明CacyBP/SIP的抑癌機制奠定良好的基礎(chǔ)。
　　【目的】1、觀察CacyBP/SIP在胃癌細胞SGC7901不同時期中亞細胞定位及蛋白表達情況。2、研究CacyBP/SIP不同時期的磷酸化水平。3、研究泛素

5、連接酶復(fù)合物成員Siah-1、Skp1及CacyBP/SIP的配體S100A6在SGC7901不同時期中亞細胞定位及蛋白表達情況,檢測Siah-1、Skp1與CacyBP/SIP的結(jié)合能力及β-catenin的表達變化。
　　【方法】1、使用雙thymidine阻滯法及nocodazole阻滯法使SGC7901細胞周期同步化,并利用流式細胞術(shù)檢測阻滯效果。利用細胞免疫熒光染色技術(shù)觀察CacyBP/SIP不同時期的亞細胞定位情況;提

6、取不同時期的細胞總蛋白及核蛋白,利用Westernblot技術(shù)檢測CacyBP/SIP不同時期表達水平。2、利用免疫沉淀及Westernblot技術(shù)檢測核內(nèi)CacyBP/SIP在不同時期的磷酸化水平。3、利用細胞免疫熒光染色技術(shù)觀察泛素連接酶復(fù)合物成員Siah-1、Skp1及CacyBP/SIP的配體S100A6在不同時期的亞細胞定位情況;利用Westernblot技術(shù)檢測它們在不同時期的表達水平;利用免疫沉淀及Westernblot技

7、術(shù)檢測核內(nèi)Siah-1、Skp1與CacyBP/SIP結(jié)合能力的變化;利用Westernblot觀察核內(nèi)β-catenin在不同時期的表達變化。
　　【結(jié)果】1、流式細胞術(shù)檢測結(jié)果提示,經(jīng)過雙thymidine阻滯法進行細胞周期同步化后,大部分SGC7901細胞阻滯于G1/S期,撤藥培養(yǎng)4h后,細胞進入S期。在8~12h,大多數(shù)細胞進入G2/M期,到16h時又重新回到G1期。經(jīng)nocodazole阻滯法同步化細胞周期,在0h時細胞

8、主要處于G2期,撤藥培養(yǎng)2h、4h、6h后,細胞主要處于G1/S期。免疫熒光染色顯示,在G1/S期時,CacyBP/SIP主要定位于胞漿,待細胞處于G2期時,則聚集于核周或入核。Westernblot分析,在總蛋白水平,各時期CacyBP/SIP蛋白表達并無明顯變化,而在核蛋白水平,G2期的CacyBP/SIP表達顯著高于G1/S期。2、免疫沉淀及Westernblot檢測顯示,G2期核CacyBP/SIP磷酸化水平顯著高于G1/S期。

9、3、為了研究CacyBP/SIP對細胞周期可能的調(diào)控機制,我們首先檢測了CacyBP/SIP泛素連接酶復(fù)合物成員分子Siah-1、Skp1是否存在細胞周期相關(guān)的定位變化。免疫熒光染色顯示,泛素連接酶復(fù)合物成員Siah-1、Skp1在G1/S期時,主要定位于胞漿,待細胞處于G2期時,發(fā)生核轉(zhuǎn)位,與CacyBP/SIP的定位一致。對其蛋白水平進行Westernblot分析,結(jié)果顯示,不同細胞時期Siah-1、Skp1總蛋白表達并無明顯變化,

10、但G2期細胞的胞核中Siah-1、Skp1蛋白表達顯著高于G1/S期細胞。同時,我們利用免疫沉淀及Westernbolt檢測了核中Siah-1、Skp1與CacyBP/SIP的結(jié)合能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在G2期,它們與CacyBP/SIP的結(jié)合能力顯著高于以G1/S期。基于先前關(guān)于泛素連接酶復(fù)合物可以降解非磷酸化β-catenin蛋白的報道,我們檢測了核內(nèi)β-catenin在不同時期的表達,研究發(fā)現(xiàn),其表達與泛素連接酶復(fù)合物的表達呈負相關(guān)。作

11、為CacyBP/SIP的配體,S100A6蛋白在此期間的定位及蛋白表達均無明顯變化。
　　【結(jié)論】1、CacyBP/SIP在胃癌細胞SGC7901中存在細胞周期依賴性核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象,在G1/S期,其主要分布于胞漿,G2期時發(fā)生核周及核轉(zhuǎn)位,并且發(fā)生了磷酸化,提示其活性可能發(fā)生了變化。2、與CacyBP/SIP類似,泛素連接酶復(fù)合物成員Siah-1、Skp1也發(fā)生G2期依賴性核轉(zhuǎn)位,且在轉(zhuǎn)位時與CacyBP/SIP的結(jié)合能力升高,提示此