1、航天失重環(huán)境可導(dǎo)致機(jī)體心血管系統(tǒng)由于重力的消失產(chǎn)生異常，即使宇航員暴露于失重環(huán)境的時間十分短暫，心血管系統(tǒng)也會產(chǎn)生一系列適應(yīng)性變化，并將直接影響宇航員身體健康，嚴(yán)重時會威脅飛行安全。這些由于失重誘發(fā)的心血管系統(tǒng)適應(yīng)性改變的綜合癥被稱作心血管失調(diào)（Cardiovasculardeconditioning,CD），表現(xiàn)以立位不耐受，心悸，暈厥為主，然而目前關(guān)于CD產(chǎn)生機(jī)制的闡釋仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠明確。內(nèi)皮細(xì)胞不僅是血液與血管組織之間天然的解剖屏障，

2、而且是血管活性器官。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅具有選擇通透性、抗血栓、調(diào)節(jié)血管緊張度、促進(jìn)毛細(xì)血管形成以及產(chǎn)生血細(xì)胞粘接因子等功能，而且還是多種血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子以及生長因子的來源和靶器官，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與多種心血管功能失調(diào)有密切的關(guān)系。
　　近年來，地面模擬研究證實-6°頭低位臥床受試者血液中可檢測到凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞；同時，另有學(xué)者在尾部懸吊后肢卸荷模型大鼠的血管組織中檢測到高表達(dá)的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducednitrico

3、xidesynthase,iNOS），提示模擬失重可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生多種異常。本研究采用地面二維回轉(zhuǎn)培養(yǎng)器（2D-clinostat）模擬細(xì)胞在空間中的受力狀態(tài)，以地面正常1g重力（Normalgravity,NG）作對照，對模擬微重力（Modeledmicrogravity,MMG）干預(yù)后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells,HUVECs）的形態(tài)與功能進(jìn)行多角度評價，為明確內(nèi)皮細(xì)胞損

4、傷可能是介導(dǎo)CD產(chǎn)生的重要機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。大量臨床與實驗室研究提示：活血化瘀類中藥對血管內(nèi)皮細(xì)胞有明確的保護(hù)作用并能通過調(diào)節(jié)其分泌血管活性物質(zhì)調(diào)節(jié)血管功能。研究表明，紅花甙（Carthamin）可抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷并改善內(nèi)皮細(xì)胞功能。因此，本研究在明確MMG導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)上，將進(jìn)一步采用Carthamin對MMG作用下HUVECs進(jìn)行干預(yù)，觀察其逆轉(zhuǎn)與修復(fù)效應(yīng)，為失重致CD的藥物防護(hù)治療提供實驗依據(jù)。
　　實驗一MMG導(dǎo)致

5、HUVECs細(xì)胞骨架重構(gòu)及其對細(xì)胞增殖、遷移的影響
　　目的：觀察MMG致HUVECs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)（纖維狀肌動蛋白和微管）的改變，并對MMG作用后細(xì)胞的增殖、遷移等功能進(jìn)行評價。
　　方法：酶消化法原代培養(yǎng)HUVECs，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）進(jìn)行鑒定，取3～5代的HUVECs進(jìn)行實驗，隨機(jī)分為2D-clinostat干預(yù)的MMG培養(yǎng)組與NG對照培養(yǎng)組，均培養(yǎng)48h；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計數(shù)及流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞增殖、凋

6、亡及細(xì)胞周期變化；Transwell觀察細(xì)胞遷移情況；免疫熒光及激光共聚焦觀察HUVECs細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：①HUVECs的培養(yǎng)與鑒定：所培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)鑒定，其CD31與Ⅷ因子為表達(dá)較高。②HUVECs骨架觀察結(jié)果：NG對照組的纖維狀肌動蛋白（fibersactin,f-actin）為束狀、放射狀，其方向感明顯，且呈現(xiàn)出具有較多偽足的纖維骨架結(jié)構(gòu)；然而MMG作用48h后，盡管f-actin沒有發(fā)生明顯的

7、崩解但是其方向感明顯消失，并且f-actin的束狀纖維也大部分消失；MMG干預(yù)48h使大量的微管蛋白發(fā)生解聚，微管的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)模糊不見，隨之代替的是崩解的微管小聚體。③細(xì)胞增殖及凋亡檢測：MMG可使HUVECs增殖明顯抑制，細(xì)胞周期抑制于G2/M期（G2/M：MMG,27.6％，NG,18.1％；P＜0.05），然而細(xì)胞并沒有發(fā)生明顯凋亡。④細(xì)胞遷移檢測：MMG干預(yù)可使HUVECs的遷移受到抑制，抑制率為-62.7％(P＜0.05)。

8、
　　結(jié)論：MMG可顯著影響HUVECs的形態(tài)與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)并抑制其增殖與遷移功能，HUVECs的增殖抑制可能與紊亂的微管結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。
　　實驗二MMG對HUVECs的FAs形成、定位以及FAs功能的影響
　　目的：對MMG干預(yù)下HUVECs的FAs多種參數(shù)進(jìn)行半定量觀測，并對FAs的酪氨酸活化水平進(jìn)行評價，進(jìn)一步檢測其中關(guān)鍵蛋白激酶和FAs中酪氨酸激酶的主要受體integrins的表達(dá)。
　　方法：激光共聚焦

9、結(jié)合高通量激光半定量計算方法，對FAs的各項參數(shù)進(jìn)行評價，其參數(shù)包括FAs平均數(shù)量(meanvinculinspotnumberpercell,VN)；FAs平均面積(meanvinculinspotarea,VA)；FAs平均交疊面積(theareapercentageofoverlapofFAs,OSP)；FAs平均到細(xì)胞邊緣距離(averagedistanceofvinculinspotsfromthecelledge,DS）。免

10、疫熒光觀察酪氨酸磷酸化（Tyrosinephosphorylation,PTyr）水平，Westernblot檢測FAK，pyk2，ILK的總表達(dá)量與磷酸化表達(dá)量，Westernblot以及RT-PCR檢測integrinβ1和β4的表達(dá)。
　　結(jié)果：①FAs形態(tài)學(xué)改變：FAs在MMG干預(yù)下，形成的數(shù)量（VN）與面積（VA）明顯減少，VN較NG對照組減少-50.6％(P＜0.05)，VA較NG對照組減少-60.2％(P＜0.05)

11、，F(xiàn)As定位指標(biāo)DS也不同于NG對照組-28.3％(P＜0.05)。②PTyr水平檢測：MMG干預(yù)后，F(xiàn)As的PTyr活化水平明顯抑制(-71.3％)(P＜0.01)。③FAs激酶活性：MMG影響后FAK，pyk2，ILK總蛋白表達(dá)沒有明顯改變，然而其磷酸化水平明顯下調(diào)，F(xiàn)AK，pyk2，ILK下調(diào)量分別為：-27.2％，-30.8％，-36.5％(P＜0.05)。④integrins結(jié)果：MMG可導(dǎo)致integrinβ1和β4在mRN

12、A與蛋白水平表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：MMG可影響HUVECs的FAs的生成以及定位，并且其與integrins相關(guān)的酪氨酸活化功能及核心激酶磷酸化水平也明顯下調(diào)。
　　實驗三Carthamin干預(yù)MMG條件下HUVECs形態(tài)和功能的實驗研究
　　目的：觀察Carthamin對MMG作用后HUVECs的增殖、遷移以及細(xì)胞骨架的影響。
　　方法：MMT摸索Carthamin作用最佳濃度，2D-clinostat進(jìn)行失重

13、模擬培養(yǎng)HUVECs，實行分組如下：NG對照組，MMG對照組，Carthamin+MMG組。采用細(xì)胞計數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞增殖，Transwell檢測細(xì)胞遷移；觀察Carthamin干預(yù)后細(xì)胞骨架蛋白的改變情況。
　　結(jié)果：①給藥濃度：Carthamin的最佳給藥濃度為10μg/ml。②細(xì)胞增殖檢測：MMG可使HUVECs增殖明顯抑制，然而Carthamin的干預(yù)并沒有逆轉(zhuǎn)MMG導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞增殖抑制的情況。③細(xì)胞遷移

14、檢測：Carthaminl孵育48h后，MMG組的遷移情況明顯改善，MMG+Carthamin組較MMG對照組遷移細(xì)胞數(shù)增加了38％（P＜0.05）。④細(xì)胞骨架結(jié)果：Carthamin干預(yù)后，盡管彌散情況沒有明顯改善，但我們可觀察到細(xì)胞的偽足較MMG對照組增多，微管改善不明顯，MMG+Carthamin組仍然顯示為彌散的數(shù)個微管亞聚體。
　　結(jié)論：Carthamin可明顯改善由于MMG作用而導(dǎo)致的HUVECs細(xì)胞遷移抑制，并修復(fù)由

15、于MMG作用導(dǎo)致HUVECs細(xì)胞骨架f-actin的骨架重排現(xiàn)象。
　　實驗四基于FAs以及RhoA對Carthamin修復(fù)MMG致HUVECs遷移抑制分子機(jī)理的實驗研究
　　目的：觀察Carthamin對MMG條件下HUVECs的FAs的影響，以及基于RhoA初步探討了其在介導(dǎo)Carthamin修復(fù)MMG致HUVECs遷移抑制的分子機(jī)制。
　　方法：2D-clinostat進(jìn)行失重模擬培養(yǎng)HUVECs，Cartham

16、in干預(yù)后檢測FAs的VA,VN及DS的變化；ExoenzymeC3Transferase抑制RhoA活性后，檢測FAs的PTyr活化情況以及下游蛋白ILK、Cofilin的磷酸化水平。
　　結(jié)果：①FAs形態(tài)學(xué)結(jié)果：Carthamin可顯著改善由于MMG導(dǎo)致HUVECs的FAs的形態(tài)學(xué)變化，采用10μg/ml的Carthamin干預(yù)處理后，MMG+Carthamin組的FAs的數(shù)量與面積較MMG對照組均明顯增加，其中VN增加30

17、.3％（P＜0.05），VA增加25.8％（P＜0.05）；進(jìn)一步對FAs的DS進(jìn)行分析，較MMG對照組MMG+Carthamin組的DS升高了36.4％。（P＜0.05）。②RhoA阻斷遷移結(jié)果：ExoenzymeC3干預(yù)RhoA活性后，Carthamin的修復(fù)效應(yīng)即被阻斷，其遷移細(xì)胞數(shù)與阻斷前比下降33.3％（P＜0.05），阻斷后的HUVECs的遷移能力與MMG對照組沒有明顯差異。③RhoA阻斷PTyr以及ILK、Cofilin的